許本姝，門(mén)夢(mèng)琪，武曉桐，姜 欣，盛思遠(yuǎn)，韓 悅，朱海峰，孟慶欣，鄧?yán)?，許修宏

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)與農(nóng)業(yè)的發(fā)展，家畜糞便、農(nóng)作物秸稈等有機(jī)廢棄物已成為主要的環(huán)境污染物，影響生態(tài)平衡和人類健康[1]。堆肥是將上述有機(jī)廢棄物混合，經(jīng)生化降解而制成的一種有機(jī)肥料，能夠使有限的資源得到二次利用。制造堆肥必須先收集適當(dāng)?shù)牟牧?，以秸稈與糞便作為堆肥原料不僅能夠減小有機(jī)廢物對(duì)環(huán)境帶來(lái)的壓力，同時(shí)能調(diào)節(jié)能源結(jié)構(gòu)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展，對(duì)實(shí)現(xiàn)環(huán)境資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2]。

氮素是堆肥過(guò)程中的重要營(yíng)養(yǎng)元素，影響堆肥的進(jìn)程及堆肥質(zhì)量。在反硝化作用過(guò)程中，氮元素以氣體的形式釋放到大氣中，影響堆肥的質(zhì)量[3-4]。反硝化反應(yīng)的過(guò)程為，氧化亞氮還原酶基因（nosZ）參與其過(guò)程中最后一步，并將N2O轉(zhuǎn)化為N2，使反硝化過(guò)程得到完全反應(yīng)的同時(shí)又能夠減少溫室氣體的產(chǎn)生。因此，學(xué)者們常以nosZ功能基因?yàn)闃?biāo)記研究反硝化細(xì)菌[5-6]。

堆肥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，不同深度堆肥中理化參數(shù)差異較大，對(duì)微生物群落組成也會(huì)產(chǎn)生不同的影響[7-8]。國(guó)外學(xué)者對(duì)細(xì)菌、真菌在堆肥不同區(qū)域的群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究[9-10]。然而動(dòng)態(tài)堆肥過(guò)程中不同深度的反硝化細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化則鮮見(jiàn)報(bào)道，且關(guān)于理化參數(shù)與反硝化細(xì)菌之間關(guān)系的研究也相對(duì)欠缺。

本試驗(yàn)以牛糞和稻草為原料，以nosZ功能基因?yàn)闃?biāo)記，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究好氧堆肥過(guò)程中不同時(shí)期與深度的nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化，并且分析理化參數(shù)對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的影響。對(duì)理解堆肥氮循環(huán)理論和促進(jìn)堆肥技術(shù)的改進(jìn)具有科學(xué)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

在哈爾濱市香坊農(nóng)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地于2016年7月1日進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，堆肥中的牛糞與水稻秸稈來(lái)自黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)畜牧業(yè)基地。堆肥材料的主要成分見(jiàn)表1。將稻稈干燥后切成3～5 cm小段后與牛糞混合均勻，調(diào)節(jié)起始C/N值為30∶1，建成約3 m×1.5m×1.5 m的堆體，堆肥全程共50 d，在堆肥的第8、23 d和41 d進(jìn)行翻堆處理。

表1 堆肥材料的主要成分Table 1 Properties of raw materials for composting

1.2 樣品采集

堆體高1.5 m。在堆肥試驗(yàn)開(kāi)始的第0、2、18、39 d和50 d進(jìn)行取樣，取樣時(shí)將堆體分為上（距堆體頂部20 cm）、中（距堆體頂部75 cm）、下（距堆體底部20 cm）三層，在各層均勻地取三個(gè)點(diǎn)分別采集500 g樣品，并按層次充分混勻，重復(fù)三次，整個(gè)堆肥過(guò)程共采集39份樣品，按堆肥天數(shù)與深度分類并分別命名為I0（第0 d）、T1（第2 d上層）、M1（第2 d中層）、B1（第2 d下層）、T2（第18 d上層）、M2（第18 d中層）、B2（第18 d下層）、T3（第39 d上層）、M3（第39 d中層）、B3（第39 d下層）、T4（第50 d上層）、M4（第50 d中層）、B4（第50 d下層）。采集后的部分樣品經(jīng)干燥、粉碎并過(guò)100目篩后常溫儲(chǔ)存，其余樣品置于-80℃冰箱中用于后期分析。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

在堆肥過(guò)程中，每日用精密數(shù)字溫度計(jì)測(cè)定每個(gè)層次（由上到下20、75、130 cm）與環(huán)境的溫度。含水率（WC）采用恒重法測(cè)定。將新鮮堆肥樣品與去離子水以1∶10（W/V）混合，用電導(dǎo)儀和pH數(shù)字儀分別測(cè)量pH值與EC值。全碳（TC）和全氮（TN）分別采用重鉻酸鉀容量法和凱氏定氮法測(cè)定[11]，碳氮比（C/N）為T(mén)C與TN的比值。氨態(tài)氮（ˉN）與硝態(tài)氮（NO-3ˉN）的含量利用流動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。種子發(fā)芽率（Germination index，GI）是判斷堆肥腐熟程度的重要指標(biāo)，利用獨(dú)行菜（Lepidium sativum L.）種子[12]測(cè)定種子發(fā)芽率。堆肥樣品與去離子水的比例為1∶10（質(zhì)量濃度比），振蕩24 h后取5 mL提取液注入有濾紙的培養(yǎng)皿中，并將20粒獨(dú)行菜種子分布均勻地放置于濾紙上，在培養(yǎng)箱中25°C遮光培養(yǎng)48 h，并用蒸餾水代替堆肥提取液作為對(duì)照組。計(jì)算方法：

GI=（堆肥浸提液的種子發(fā)芽率×種子根長(zhǎng)）/（對(duì)照組種子發(fā)芽率×種子根長(zhǎng)）×100%

除溫度以外的所有指標(biāo)均進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)定。

1.4 樣品DNA的提取與PCR擴(kuò)增

用CTAB法從堆肥樣品中提取總DNA[13]，使用Omega凝膠回收試劑盒（Omega Bio-Tek，Inc.，GA，USA）并根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示將提取粗DNA進(jìn)行純化。純化后的DNA存儲(chǔ)在-80℃條件下以減少樣本的變化。以各個(gè)樣品的DNA為模板，以nosZ-1F（5′-CGY TGT TCM TCG ACA GCC AG-3′）和nosZ-1622R（5′-CGS ACC TTS TTG CCS TYG CG-3′）為引物擴(kuò)增nosZ基因[14]。PCR反應(yīng)體系與條件為：共75 μL PCR體系包含37.5 μL Taq-HS PCR Forest Mix（2X），模板 1 μL，上下游引物各 0.6 μL，補(bǔ)充 dd H2O到 75 μL。94℃預(yù)變性4 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min，最后4℃反應(yīng)終止。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并使用Omega凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.5 nosZ型反硝化細(xì)菌高通量測(cè)序

將純化后的PCR產(chǎn)物在四川貝博特生物科技有限公司Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SUB4856116。

1.6 生物信息處理

根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系進(jìn)行拼接過(guò)濾并去除嵌合體，在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類獲得可操作分類單元（OTU，Operational taxonomic units），使用Mothur（Version v.1.30）軟件，對(duì)樣品alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估（Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)），基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用QIIME軟件（Version 1.8.0）生成物種豐度表，利用R語(yǔ)言Vegan包中的RDA分析來(lái)反應(yīng)各樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與理化參數(shù)之間的相關(guān)性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件對(duì)堆肥的理化參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（One way-ANOVA，Tukey HSD法），對(duì)反硝化細(xì)菌的多樣性與豐富度進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，概率值P＜0.05代表相關(guān)關(guān)系顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥過(guò)程中理化參數(shù)及GI指標(biāo)的變化

堆體高1.5 m。堆肥各層的溫度分布如圖1所示，箭頭表示翻堆時(shí)間。在整個(gè)過(guò)程中，堆肥經(jīng)歷了升溫（0～12 d）、高溫（13～27 d）、降溫（28～46 d）和腐熟（47～50 d）四個(gè)時(shí)期，堆體的溫度在堆肥開(kāi)始后立即升高，堆體上層與中層的溫度在堆肥開(kāi)始的第4 d即達(dá)到了55℃，而下層的溫度在第11 d才達(dá)到55℃，這種現(xiàn)象是由于堆肥下層的通風(fēng)較差，氧氣含量較低，微生物代謝緩慢，導(dǎo)致下層溫度升高較慢[15-16]。堆肥過(guò)程中，各層溫度均達(dá)到了55℃并持續(xù)了5 d以上，足以殺死堆體中的病原菌而使堆肥達(dá)到無(wú)害化[17]。堆肥進(jìn)行到第28 d，堆體的上中下層的溫度同時(shí)開(kāi)始下降，并在第47 d達(dá)到了腐熟期。整個(gè)堆肥過(guò)程中，上層和中層的溫度基本上高于下層，并且翻堆會(huì)造成堆體溫度明顯波動(dòng)。

圖1 堆肥過(guò)程中溫度的變化Figure 1 Changes of temperature during composting process

在堆肥過(guò)程中的升溫與高溫階段，pH值緩慢升高，這可能是由于隨著堆肥的進(jìn)行，通過(guò)氨化作用使有機(jī)酸分解[18]，使pH值從7.93增加到8.90（見(jiàn)表2）。而到了降溫期，堆肥的pH值開(kāi)始下降，最終達(dá)到了有機(jī)肥料可施用標(biāo)準(zhǔn)的微堿性環(huán)境（pH值范圍7.5～9.0）[19]。在堆肥的高溫階段，上層與中層的pH值分別達(dá)到了8.9和8.62，而下層只達(dá)到了8.20（P＜0.05），這可能是由于堆肥上層相對(duì)于堆體其他層次通風(fēng)量較大，參與氨化作用的微生物大多為好氧微生物，因此在堆肥上層的活動(dòng)相對(duì)劇烈[20]。電導(dǎo)率（EC）與堆肥中的含鹽量有著十分緊密的關(guān)系，EC值超過(guò)4.3 mS·cm-1時(shí)會(huì)不利于作物的正常生長(zhǎng)[21]。從表1數(shù)據(jù)得知，堆肥過(guò)程中EC最高值為2.14 mS·cm-1，因此符合要求標(biāo)準(zhǔn)。含水率（WC）在堆肥過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，在堆肥的第50 d含水率下降至45.21%～53.44%，且下層的含水率較上層和中層稍高，這可能是由于上層和中層的通風(fēng)條件加速了含水量的降低[15]。NH+4ˉN在堆肥過(guò)程中先升高再減低，這是由于堆肥前期氨化細(xì)菌通過(guò)氨化作用使堆肥中的氮素分解為NH+4ˉN，導(dǎo)致ˉN含量逐漸增加，而到了堆肥后期，硝化作用使堆體中的轉(zhuǎn)化為-N，另外由于NH3的揮發(fā)，ˉN含量開(kāi)始下降[22]。在堆肥的高溫期與降溫期，NH+4ˉN上層和中層的含量顯著高于下層（P＜0.05）。且上層的NH+4ˉN含量持續(xù)高于中層和下層的現(xiàn)象持續(xù)至堆肥結(jié)束，這可能是由于堆體上層具有相比底層較高的溫度環(huán)境和相比中層較好的通風(fēng)條件，因此有利于氨化細(xì)菌的繁殖與氨化反應(yīng)的進(jìn)行[23]。而NO-3-N含量在堆肥升溫期過(guò)后急速上升。這與以往的研究結(jié)果相一致，過(guò)高的溫度會(huì)抑制硝化細(xì)菌的活性，隨著堆體溫度的降低，硝化細(xì)菌活性增強(qiáng)，氨態(tài)氮經(jīng)硝化作用轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，導(dǎo)致NO-3-N含量升高[24]。C/N是判斷堆肥腐熟度的指標(biāo)之一，一般情況下，C/N小于20即可判定堆肥基本腐熟[25]，通過(guò)表2可知，除中層的C/N值稍高于腐熟標(biāo)準(zhǔn)（20.14），其他各層的C/N值均達(dá)到了要求。種子發(fā)芽率（GI）是判斷堆肥腐熟程度的重要指標(biāo)，當(dāng)發(fā)芽率大于80.0%時(shí)證明堆肥的毒性已經(jīng)喪失并腐熟[26]。本實(shí)驗(yàn)上中下層的種子發(fā)芽率均達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)值，證明堆肥各層均已達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)并對(duì)植物失去毒性。

2.2 堆肥中nosZ型反硝化細(xì)菌群落的豐富度及多樣性

在所有堆肥樣品中共獲得了872 502個(gè)序列（見(jiàn)表3），各個(gè)樣品序列條數(shù)在12 717～55 863。在97%相似度的基礎(chǔ)上劃分共獲得449個(gè)OTU，序列長(zhǎng)度范圍為200～500 bp。所有樣品基因文庫(kù)的覆蓋率指數(shù)均高于0.99，表明獲得的測(cè)序結(jié)果足以代表堆肥中nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。測(cè)序結(jié)果表明在不同采樣地點(diǎn)的OTU數(shù)量和分布各不相同。nosZ型反硝化基因的OTU數(shù)量在堆肥開(kāi)始時(shí)最高，隨著堆肥的推進(jìn)OTU數(shù)量逐漸減少，在腐熟階段達(dá)到最低。這可能是在堆肥的最初階段，堆體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度較高，利于反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)[18]。此外，在整個(gè)堆肥過(guò)程中，上層的OTU數(shù)量始終高于中層和底層。Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，樣品內(nèi)物種Simpson指數(shù)代表樣品中物種組成的多樣性，數(shù)值大小與物種多樣性呈反比，數(shù)值越大代表多樣性越低[27]。本研究的堆肥體系中Simpson指數(shù)先增大后減小，說(shuō)明反硝化細(xì)菌的多樣性先降低后升高，并且在堆肥的降溫期，上層與下層的多樣性呈顯著性差異（P＜0.05）。ACE指數(shù)表示樣品中反硝化細(xì)菌的豐富度，ACE指數(shù)越高，反硝化細(xì)菌的豐富度越高[28]。ACE指數(shù)在堆肥過(guò)程中先減小后增大，表明反硝化細(xì)菌的豐富度與多樣性趨勢(shì)相似，先降低后升高。堆肥過(guò)程中豐富度的變化可能是由于溶解有機(jī)碳（DOC）濃度引起的，有研究表明nosZ基因豐富度與溶解有機(jī)碳濃度顯著相關(guān)[29]。此外在堆肥過(guò)程中，堆體各層的豐富度并沒(méi)有體現(xiàn)出顯著性差異。

表2 堆肥過(guò)程中理化及GI指標(biāo)的變化Table 2 Changes of physic-chemical and GI indices during composting process

表3 堆肥過(guò)程中MiSeq測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)Table 3 MiSeq sequencing results and diversity indices during composting process

2.3 堆肥中nosZ型反硝化細(xì)菌的群落組成

39個(gè)堆肥樣品中的449條OTU分屬于1門(mén)3綱8目12科14屬15種。圖2為nosZ型反硝化細(xì)菌在屬水平上群落組成的動(dòng)態(tài)變化，圖中顯示了過(guò)濾掉unclassified后豐度水平前10的物種，并將其他豐度水平物種合并為Others。假單胞菌屬（Pseudomonas）、鮑特氏菌屬（Bordetella）、陶厄氏菌屬（Thauera）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、Polymorphum、卡斯特蘭尼氏菌屬（Castellaniella）、生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、螯臺(tái)球菌屬（Chelatococcus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）為各樣品中主要的反硝化細(xì)菌。堆肥第0 d，假單胞菌屬（54%）、鮑特氏菌屬（17%）、陶厄氏菌屬（12%）、生根瘤菌屬（11%）為優(yōu)勢(shì)菌屬。當(dāng)堆肥進(jìn)行到升溫期，陶厄氏菌屬的相對(duì)豐度顯著上升，成為升溫期的優(yōu)勢(shì)菌屬，且上層與下層其相對(duì)豐度相比中層較高。這是由于陶厄氏菌屬是β-變形菌門(mén)下的革蘭氏陰性細(xì)菌，大多數(shù)為桿狀且具有反硝化能力，并適合在中性pH和中溫環(huán)境中生長(zhǎng)[30-31]，與此同時(shí)無(wú)色桿菌屬的相對(duì)豐度在升溫階段也稍有增加。堆肥高溫期各層反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的差異，堆肥上層和下層的假單胞菌屬含量上升并分別達(dá)到了83%和66%。有研究表明土壤N2O的排放量與溫度呈正相關(guān)，并且在N2O排放量較高的階段檢測(cè)到了大量假單胞菌的nosZ基因片段[32-33]。而中層的假單胞菌屬的相對(duì)豐度僅為38%，這可能是中層與下層氧氣含量的差異引起的。此外，無(wú)色桿菌屬在中層的相對(duì)豐度也迅速增加。在堆肥開(kāi)始的第39 d，假單胞菌屬含量降低，上層與中層的螯臺(tái)球菌屬、卡斯特蘭尼氏菌、無(wú)色桿菌屬的相對(duì)豐度增加，鮑特氏菌屬在堆肥下層的相對(duì)豐度迅速增加并達(dá)到了68%。堆肥的腐熟期，三層之間的群落組成相似，鮑特氏菌屬依然為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，有研究表明鮑特氏菌屬更適合在中溫與中性的環(huán)境下生長(zhǎng)[34]。假單胞菌屬在堆肥過(guò)程中的初始、升溫及高溫階段相對(duì)豐度均為最高，為堆肥過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。有研究表明假單胞菌屬具有生長(zhǎng)速度快及高效脫氮的特點(diǎn)[35]。因此根據(jù)該菌屬的生長(zhǎng)習(xí)性調(diào)節(jié)堆肥理化參數(shù)能夠有效控制堆肥反硝化反應(yīng)的進(jìn)程并可減少溫室氣體N2O的排放。

2.4 堆肥中nosZ型反硝化細(xì)菌群落組成與理化指標(biāo)的相關(guān)性

圖2 堆肥樣品中nosZ型反硝化細(xì)菌在屬分類水平上群落組成的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Changes of community composition of nosZ type denitrification bacteria during composting process at the level of genus

堆肥中的群落結(jié)構(gòu)主要是受環(huán)境因素（溫度、pH、氮、含水率等）和堆肥基質(zhì)的影響[36]。了解理化參數(shù)與微生物之間的關(guān)系，找出影響微生物群落的主要因素，可以有效地調(diào)控微生物群落，從而改善堆肥過(guò)程[37]。因此，采用冗余分析（RDA）方法分析堆肥過(guò)程中理化因素對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)堆肥豐度前10的反硝化細(xì)菌屬與理化因素之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。如圖3a所示，前兩個(gè)排序軸分別解釋了40.15%和21.24%的變化，因此理化因素顯著影響堆肥過(guò)程中反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。箭頭的矢量線長(zhǎng)短表示著不同理化參數(shù)與樣品之間的相關(guān)性大小，矢量線越長(zhǎng)相關(guān)性越大[38]。因此根據(jù)箭頭連線的長(zhǎng)度可看出，各理化因素中C/N（CN）、含水率（WC）、pH為影響樣品反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為顯著的環(huán)境因子，其次為EC、溫度（Temp）、NH+4ˉN（AN）、NO-3ˉN（NN）。含水率是影響堆肥中微生物活性關(guān)鍵的影響因素[39]。有研究指出若堆肥中含水率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致堆體內(nèi)部形成厭氧環(huán)境，更有利于大部分為厭氧菌的反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖[26]。Meng等[40]利用PCRDGGE技術(shù)分析反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明pH和溫度顯著影響nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。圖中各點(diǎn)代表堆肥樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間的關(guān)系由點(diǎn)之間的距離表示，距離越近代表樣品組成越相似，從圖3a可以觀察到，堆肥前期（0～2 d）的樣品匯聚在第一象限，而堆肥后期（18～50 d）的樣品集中在第四象限內(nèi)，堆肥升溫期中層的樣品與同時(shí)期其他兩層樣品之間的連線以及降溫期的各樣品之間連線距離較遠(yuǎn)，因此這兩個(gè)時(shí)期反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)受層次影響較大。圖3b顯示了堆肥過(guò)程中的nosZ型反硝化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度前10）與理化參數(shù)之間的關(guān)系。螯臺(tái)球菌屬與溫度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Polymorphum與NO-3ˉN含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），卡斯特蘭尼氏菌屬與C/N呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），生根瘤菌屬與NO-3ˉN含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與NH+4ˉN和溫度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與含水率和C/N呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01），無(wú)色桿菌屬與溫度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），紅假單胞菌屬與溫度和NH+4ˉN呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），鹽單胞菌屬和陶厄氏菌屬均與C/N呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與NO-3ˉN含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.5 理化參數(shù)對(duì)nosZ型反硝化細(xì)菌群落多樣性與豐富度的影響

堆肥過(guò)程中的反硝化細(xì)菌的多樣性與溫度、pH、NH+4ˉN、NO-3ˉN之間呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01）（見(jiàn)表4），與C/N、含水率之間呈顯著相關(guān)性（P＜0.05）。并且影響程度由大到小依次為：溫度＞pH＞NO-3ˉN＞NH+4ˉN＞C/N＞含水率，其中溫度、pH、NH+4ˉN、含水率、C/N與反硝化細(xì)菌的多樣性呈反比，NO-3ˉN與反硝化細(xì)菌的多樣性呈正比。表明在本研究的堆肥過(guò)程中，反硝化細(xì)菌對(duì)溫度和pH敏感性較強(qiáng)。堆肥過(guò)程中反硝化細(xì)菌的豐富度僅與溫度呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01），豐富度隨著溫度升高而減小。這與以往研究結(jié)果一致，過(guò)高的溫度和pH值會(huì)影響微生物的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)[17，40]。

3 結(jié)論

（1）在牛糞稻草堆肥過(guò)程中，不同時(shí)期的nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，反硝化細(xì)菌的多樣性和豐富度在堆肥過(guò)程中均先降低后升高。假單胞菌屬、陶厄氏菌屬為堆肥升溫期的反硝化優(yōu)勢(shì)菌屬，假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬為高溫期的優(yōu)勢(shì)菌屬，鮑特氏菌屬為堆肥腐熟期的優(yōu)勢(shì)菌屬。除此之外，堆肥降溫期不同深度堆肥中菌群結(jié)構(gòu)與多樣性指數(shù)差異顯著，各層次優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同。可見(jiàn)，nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性在堆肥不同階段和不同深度均存在差異。

圖3 理化參數(shù)與樣品（a）及nosZ型反硝化細(xì)菌（b）在屬水平上的RDA分析Figure 3 RDA analysis of physic-chemical parameters between samples（a）and denitrifying bacteria（b）at the genus level

表4 理化參數(shù)與反硝化細(xì)菌群落Simpson和ACE指數(shù)的Spearman相關(guān)性系數(shù)Table 4 Spearman correlations coefficient between physic-chemical parameters and denitrifying bacteria Simpson as well as ACE indices

（2）理化因素對(duì)反硝化細(xì)菌有著不同程度的影響，C/N、含水率、pH對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響最為顯著，螯臺(tái)球菌屬與溫度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Polymorphum與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），生根瘤菌屬與含水率和C/N呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。溫度、pH、氨態(tài)氮與反硝化細(xì)菌多樣性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），硝態(tài)氮與反硝化細(xì)菌的多樣性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），溫度與反硝化細(xì)菌豐富度呈顯極著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。