巴多 扎西多吉 次旦卓瑪 歐珠 平措占堆洛桑達瓦 朱彥賓 孫光明 洛 桑 達娃央拉 次旦央吉 巴桑旺堆 尼瑪次仁 洛桑頓珠 益西吐登 周全

摘要? ? 本研究利用18對微衛(wèi)星對改則縣的16頭本地牦牛和18頭半野血牦牛進行遺傳多樣性評估。結(jié)果顯示，18對微衛(wèi)星的平均等位基因數(shù)為7.44，其中TGLA73、BM2113和BGR3012等3個位點的觀測雜合度最高，為1.000 0，AGLA293位點的觀測雜合度最小，為0.204 9。改則縣本地牦牛的期望雜合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、觀測雜合度（HO±SD=0.724 3±0.027 0）、平均等位基因數(shù)（NA=6.22±2.86）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.636）均要高于改則縣半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）。2個群體之間的遺傳分化指數(shù)FST=-0.005 42，同時結(jié)合主成分分析，發(fā)現(xiàn)2個群體遺傳分化不明顯。

關(guān)鍵詞? ? 微衛(wèi)星;遺傳多樣性;半野血牦牛;西藏改則

中圖分類號? ? S823? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）16-0173-03? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? Using 18 microsatellites，genetic diversity assessment of 16 local yak and 18 half-wild yak from Gaize County was studied.The results showed that the average number of alleles of 18 pairs of microsatellites was 7.44.The observed heterozygosity of the three loci（TGLA73，BM2113 and BGR3012）was highest（1.000 0），and the smallest observed heterozygosity of AGLA293 was 0.2049.The expected heterozygosity（HE±SD=0.700 0±0.042 2），observed heterozygosity（HO±SD=0.724 3±0.027 0），average allele number（NA=6.22±2.86）and polymorphic information content（PIC=0.636）of the local domestic yak were higher than those of the semi-wild blood yak respectly（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）.The genetic differentiation index FST=-0.005 42 between the other two populations，combined with principal component analysis，it is found that the genetic differentiation of the two populations was not obvious.

Key words? ? microsatellite;genetic diversity;semi-wild blood yak;Gaize Tibet

改則縣隸屬西藏自治區(qū)，地處西藏西北部、阿里地區(qū)的東部、藏北高原腹地。東與那曲地區(qū)的雙湖、尼瑪縣相接，東南與措勤縣相連，南與日喀則市的仲巴縣毗鄰，西與革吉縣、日土縣接壤，北以昆侖山為界與新疆維吾爾自治區(qū)交界。東西長450 km，南北寬670 km，總面積13.56萬km2，是阿里地區(qū)面積最大的一個純牧業(yè)縣，約占阿里地區(qū)總面積的1/3。

微衛(wèi)星是20世紀80年代后期開發(fā)的分子標記。微衛(wèi)星廣泛分布在整個基因組中，富含多態(tài)性，高分辨率，相對高度保守，共顯性，易于檢測和重現(xiàn)[1-3]。微衛(wèi)星技術(shù)被廣泛地應用于豬[4-7]、牛[8-12]和羊[13-16]的遺傳資源鑒定工作中。微衛(wèi)星標記在牦牛中也得到了應用，例如，羅 輝等[17]和蔡 欣等[18]分別利用微衛(wèi)星分子標記研究了麥洼牦牛的遺傳多樣性;鐘金城等[19]利用微衛(wèi)星分析標記對麥洼牦牛、九龍牦牛、大通牦牛、天祝白牦牛的遺傳多樣性及其分類進行研究;毛永江等[20]利用微衛(wèi)星標記和血液蛋白基因坐標記方法研究青海高原牦牛內(nèi)的遺傳多樣性;張浩[21]利用微衛(wèi)星對甘肅省天?？h的5個天祝白牦牛群體進行了近交系數(shù)的研究;李 鐸等[22]利用微衛(wèi)星DNA研究了西藏11個牦牛類群的遺傳多樣性及類群間的系統(tǒng)進化關(guān)系。

本研究利用微衛(wèi)星標記從DNA水平上對改則縣的本地牦牛和半野血牦牛進行遺傳多樣性評估，為評價、保護和利用改則縣的牦牛遺傳資源提供理論依據(jù)。

1? ? 材料與方法

選擇改則縣本地牦牛16頭和半野血牦牛18頭（表1），采集靜脈血，帶回實驗室，于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ没蚪MDNA提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取全血中的基因組DNA，-20 ℃保存。

參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和國際動物遺傳學會（ISAG）聯(lián)合推薦的引物，本研究選取了其中18對SSR引物，并在引物序列上游5′端加上FAM等熒光標記，以便檢測。將引物進行組合擴增，并對PCR過程進行優(yōu)化，熒光標記，獲得PCR產(chǎn)物。所用引物和片段大小見表2。采用20 μL PCR反應體系，其中各組分的終濃度分別為dNTPs 0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、DNA模板1 μL（約60 ng）。PCR反應程序為94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過35個循環(huán);于72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測分析。PCR產(chǎn)物用ABI 3130 xl全自動基因分析儀進行分型檢測。

利用以下軟件分析數(shù)據(jù)：Microsatellite Toolkit軟件[23]計算各遺傳位點的等位基因數(shù)（Number of alleles，NA）、多態(tài)信息含量（Polymorphic information content，PIC）、觀察雜合度（Ob-served Heterozygosity，HO）和期望雜合度（Expected He-terozygosity，HE）等參數(shù);Arlequin 3.5軟件[24]計算物種內(nèi)群體間遺傳分化指數(shù)（FST）;GENEPOP 3.4軟件[25]進行哈德溫伯格平衡檢驗（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）;Fstat 2.9軟件[26]計算群體近交系數(shù)（FIS）;主成分分析（PCA）利用R語言腳本分析。

2? ? 結(jié)果與分析

由表3可知，就位點而言，18個微衛(wèi)星中AGLA293位點的期望雜合度（HE=0.193 7）、觀測雜合度（HO=0.204 9）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.177 9）均是最小的。TGLA122位點的期望雜合度（HE=0.912 5）最大;有3個位點（TGLA73、BM-2113和BGR3012）的觀測雜合度最大，為1.000 0;TGLA122位點的PIC值最大，為0.868 8。18個微衛(wèi)星中平均發(fā)現(xiàn)了7.44個等位基因數(shù)，等位基因數(shù)范圍3（BM2113）～14（TGLA-122）。18個微衛(wèi)星中只有6個位點在這2個牦牛群體中偏離了哈代溫伯格平衡，其中SPS115和BGR3020位點只在一個牦牛群體中偏離了哈代溫伯格平衡，MGTG7、BM2113、BGR3019和BGR3012這4個位點在2個牦牛群體中均偏離了哈代溫伯格平衡。

在2個改則縣牦牛群體的34個個體的18個微衛(wèi)星中共發(fā)現(xiàn)了134個等位基因數(shù)，平均等位基因數(shù)為7.44。本研究選取的18個微衛(wèi)星位點中，BGR3011位點為中度多態(tài)，AGLA293位點為低度多態(tài)，其余16個位點均為高度多態(tài)。說明2個牦牛群體遺傳多樣性水平較高，均有足夠的基因資源存在于牦牛群體內(nèi)。并且18個微衛(wèi)星位點中有10個位點的觀測雜合度大于期望雜合度，其中有3個位點的觀測雜合度為1.000 0，這也說明了2個牦牛群體中的遺傳多樣性水平較高。

就群體而言，改則縣本地牦牛內(nèi)的期望雜合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、觀測雜合度（HO±SD =0.724 3±0.027 0）、平均等位基因數(shù)（NA=6.22±2.86）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.636）均要高于改則縣半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622），2個群體的觀測雜合度均要高于期望雜合度。近交系數(shù)在2個群體中均為負值，說明這2個牦牛群體均表現(xiàn)為雜合子過度。2個牦牛群體中都各有5個微衛(wèi)星位點偏離了哈代溫伯格平衡。然而根據(jù)遺傳多樣性各項參數(shù)綜合考量，這2個群體遺傳多樣性尚表現(xiàn)豐富，暗示2個群體保種情況良好，具有進一步開發(fā)利用的潛力。

此外，改則縣本地牦牛品種與半野血牦牛之間的的多樣性指標數(shù)值相差不大，說明2個群體之間差異性可能很?。ū?），進一步計算2個群體間間遺傳分歧（FST值），結(jié)果顯示FST值為-0.005 42，差異不顯著（P>0.05），進一步表明了2個群體間的差異性較小。同時PCA分析結(jié)果（圖1）顯示，2個群體存在大量個體間表現(xiàn)高度親緣相近，這可能暗示了由于兩者棲息地較近，在放牧過程中可能存在頻繁的基因交流，或認為的串換種畜所致[27]。

3? ? 結(jié)論

評估結(jié)果表明，改則縣2個牦牛群體中的遺傳多樣性水平較高，且遺傳分化不明顯。

4? ? 參考文獻

[1] 王曉靜，霍生東，陳士恩，等.‘早勝牛微衛(wèi)星基因位點遺傳多樣性分析[J].中國農(nóng)學通報，2015，31（2）：1-7.

[2] 張娜娜.11個微衛(wèi)星和BMP15外顯子在兩個山羊品種中遺傳多樣性研究[D].洛陽：河南科技大學，2010.

[3] 朱蘭，孫利民，梁家充，等.利用微衛(wèi)星標記分析云南省10個山羊品種的遺傳多樣性[J].中國畜牧雜志，2019，55（1）：57-63.

[4] 孫瑞萍，魏立民，晁哲，等.封閉群五指山小型豬33個微衛(wèi)星位點的遺傳分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，46（21）：164-169.

[5] 李慶崗，王重龍，楊家軍，等.5個安徽地方豬種和5個引進豬種微衛(wèi)星標記遺傳多樣性分析[J].養(yǎng)豬，2018（3）：67-72.

[6] 歐陽依娜，江炎庭，孫利民，等.10個云南地方豬種微衛(wèi)星遺傳多樣性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2018，45（4）：992-1001.

[7] 趙思思，賈青，胡慧艷，等.河北省4個黑豬群體的遺傳多樣性分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報，2017，40（2）：79-83.

[8] 王彥環(huán)，吳慧，房興堂，等.夏南牛與13個黃牛群體mtDNA及微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性比較研究[J].家畜生態(tài)學報，2018，39（3）：17-23.

[9] 楊紅文，韓勇，劉鏡，等.微衛(wèi)星標記對4個貴州地方牛品種遺傳多樣性研究[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2016，40（5）：5-9.

[10] 王曦.晉南牛與部分地方黃牛之間遺傳多樣性分析[C]//中國畜牧業(yè)協(xié)會牛業(yè)分會.第九屆（2014）中國牛業(yè)發(fā)展大會論文集·澄邁：中國畜牧協(xié)會，2014：14.

[11] 張元慶，王曦，李福星，等.晉南牛保種群部分微衛(wèi)星遺傳多樣性分析[J].中國畜牧雜志，2014，50（3）：22-26.

[12] 吳蕓，蔣自立，田雄，等.務川黑牛微衛(wèi)星座位遺傳多樣性分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2012，41（12）：141-145.

[13] 王可，劉昭華，崔緒奎，等.濟寧青山羊微衛(wèi)星標記多態(tài)性分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2017，49（2）：142-146.

[14] 呂曉陽，孫偉，張想想，等.利用9個微衛(wèi)星標記分析海門山羊和徐淮山羊的遺傳多樣性[J].中國畜牧雜志，2016，52（15）：5-11.

[15] 李曉雨，張紀剛，狄冉，等.利用微衛(wèi)星標記分析5個山羊品種的遺傳多樣性和進化關(guān)系[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2015，42（4）：520-528.

[16] 沈偉，李蘭，潘慶杰，等.山羊經(jīng)濟性狀標記輔助選擇的遺傳效應分析[J].遺傳，2004（5）：625-630.

[17] 羅輝，趙芳芳，孫磊，等.麥洼牦牛基因組三堿基重復微衛(wèi)星的挖掘及其遺傳多態(tài)性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（5）：1438-1445.

[18] 蔡欣，澤讓東科，趙芳芳，等.麥洼牦牛群體4個新微衛(wèi)星位點遺傳多態(tài)性分析[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2014，42（5）：29-32.

[19] 鐘金城，趙素君，陳智華，等.牦牛品種的遺傳多樣性及其分類研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006（2）：389-397.

[20] 毛永江，常洪，楊章平，等.青海高原牦牛遺傳多樣性研究[J].家畜生態(tài)學報，2008（1）：25-30.

[21] 張浩.五個天祝白牦牛群體近交程度分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2014，35（5）：7-9.

[22] 李鐸，柴志欣，姬秋梅，等.西藏牦牛微衛(wèi)星DNA的遺傳多樣性[J].遺傳，2013，35（2）：175-184.

[23] PARK S D E.Trypanotolerance in West African cattle and the population genetic effects of selection[D].Ph.D.thesis，University of Dublin，2001.

[24] EXCOFFIER L，LISCHER H E L.Arlequin suite ver 3.5：A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Win-dows[J].Molecular ecology resources，2010，10（3）：564-567.

[25] RAYMOND M，ROUSSET F.GENEPOP（Version 1.2）：Population gene-tics software for exact tests and ecumenicism[J].Journal of Heredity，1995，86（3）：248-249.

[26] GOUDET J.FSTAT（Version 1.2）：A computer program to calculate F-statistics[J].Journal of Heredity，1995，86（6）：485-486.

[27] 左福元，王玲，劉昌林.肉牛雜交親本遺傳距離與雜種優(yōu)勢的相關(guān)性研究[J].中國畜牧雜志，2010，46（11）：1-4.