劉江，雷激，張俊，蘇菲煙

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

調配型酸性乳飲料是一種以鮮奶、奶粉為主要原料，輔以其他原料如甜味劑、穩(wěn)定劑、香精等調配獲得的，是當前市售蛋白質飲料中最流行的品種之一[1]。乳制品生產過程受體系酸度、添加劑等因素的影響，產品質量不穩(wěn)定，易出現分層、沉淀等現象，這些是新型乳制品開發(fā)的難點，制約著酸性乳飲料產品的生產和開發(fā)[2]。牛乳酪蛋白的等電點為4.6，高于酸性乳飲料(pH 3.8～4.2)，酪蛋白凝聚沉淀會使酸性乳飲料穩(wěn)定性受到破壞。故要提高產品的穩(wěn)定性，關鍵是解決牛乳酪蛋白在酸性條件下的穩(wěn)定性，這需增加酪蛋白之間的靜電相互作用，同時改善加劇酪蛋白聚集沉淀的不利因素的影響，可通過添加穩(wěn)定劑來實現。

羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose，CMC)、藻酸丙二醇酯(propylene glycol alginate，PGA)和果膠被認為是能夠有效穩(wěn)定酸性乳飲料的親水膠體[3]。目前酸性乳飲料穩(wěn)定性的研究主要是測定酸性乳飲料的黏度、沉淀量和乳析率等來表征，這些在測量過程中會破壞酸性乳飲料的結構，對分析其穩(wěn)定性具有一定的局限性。基于此，本試驗重點研究不同穩(wěn)定劑最佳添加量下產品的粒徑分布、Zeta電位、水分子的流動性及流變性等指標的變化，從微觀角度研究不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料的穩(wěn)定作用，分析產品中蛋白質穩(wěn)定性問題，對了解不同穩(wěn)定劑穩(wěn)定酸性乳飲料的機制和拓展其應用領域有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

伊利脫脂奶粉，雙城雀巢有限公司；檸檬果膠粉，微波輔助法提取的檸檬果膠(自制,詳見1.2.2)；金裝白砂糖，眉山市新紀元食品有限公司；食品級CMC，南京通盈生物科技有限公司；食品級PGA，鄭州明瑞化工有限公司；食品級蔗糖酯，鄭州富太化工產品有限公司；檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設備

TB-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-320 pH計，上海霄盛有限公司；TD-5M低速離心機，四川蜀科儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；78-1磁力攪拌機，金壇市富華儀器有限公司；FSH-2A均質機，河北慧采科技有限公司；UV-2450紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；FY-10型微波萃取儀，上海越眾儀器設備有限公司；低頻核磁共振分析儀(LF-NMR)，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；MCR xx2流變儀，奧地利安東帕(中國)有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度儀，英國Malvern儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程[5]

1.2.2 操作要點

(1)微波輔助提取檸檬果膠(microwave assisted extraction lemon pectin，MAELP)：參考文獻[4]制備檸檬干渣，0.05 mol/L EDTA為提取溶劑，干渣與提取液的料液比1∶22(g∶mL)，用0.5 mol/L檸檬酸調節(jié)pH值為2.3，在320 W功率下提取8 min；提取液離心過濾后經60 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至原體積1/2，用2倍體積的90%乙醇沉淀45 min，并用無水乙醇洗滌4次，最后于60 ℃真空干燥粉碎得到果膠成品；

(2)復原乳配方：將6.0 g脫脂奶粉溶解在30 mL，40 ℃的蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌溶解，然后于90 ℃殺菌10 min；

(3)穩(wěn)定劑膠體溶液的制備：將穩(wěn)定劑與6%蔗糖、0.05%檸檬酸鈉、0.1%蔗糖酯充分混合均勻后，將混合物緩慢加入75 ℃蒸餾水中，勻速攪拌并冷卻至20 ℃，保證膠體充分溶解，制成膠體溶液(各成分添加的百分比為配制100 mL飲料的質量比)；

(4)原料混合：將穩(wěn)定劑膠體溶液與復原乳混合均勻，不加穩(wěn)定劑的作為空白對照；

(5)調酸：采用滴加法，用10%檸檬酸溶液進行調酸，并使用攪拌器對溶液不斷地進行高速攪拌，使pH值最終為4.0。必須保證各體系溶液溫度控制在30 ℃以下，目的是為降低加酸過程中蛋白質的變性程度，同時應控制速度，保證充分分散；

(6)均質：樣品加熱到60 ℃后在20 MPa下分3階段均質，前2次每次均質2 min，間歇1 min，最后1次均質1 min；

(7)殺菌：均質后的產品于90 ℃殺菌10 min，將殺菌后的產品裝入經紫外消毒的塑料瓶中，密封，該操作在無菌操作臺上完成。經檢驗，產品達到商業(yè)無菌要求，可在常溫下長期保存。

1.2.3 酸性乳飲料試驗方法

采用1.2.2所示工藝制備酸性乳飲料，選取提取的檸檬果膠、CMC和PGA添加量分別為質量分數0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%，在室溫儲藏1 d后檢測酸性乳飲料沉淀率，確定穩(wěn)定劑的最佳添加量，在最佳添加量下測定不同穩(wěn)定劑對產品感官、粒徑分布、Zeta電位、水分子流動性以及流變性等的影響。

1.3 實驗指標測定方法

1.3.1 酸性乳飲料沉淀率[6]

稱量離心管的質量為W1，加入30 g酸性乳飲料樣品(精確度為0.001 g)，放入離心機中，3 800 r/min離心20 min，去除上清液并倒立5 min，稱其質量為W2。每個樣品進行3次平行測定，離心沉淀率取其平均值，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：W1,離心管質量，g；W2,倒立后離心管和樣品質量。

1.3.2 酸性乳飲料感官評定

感官評分參照GB/T 21732—2008《含乳飲料》國家標準感官質量評鑒細則，評分標準見表1。由20名專業(yè)人士組成鑒評小組，對酸性乳飲料進行感官(包括色澤、滋味氣味、組織狀態(tài))評價，總分100分，結果取其平均值[7]。

表1 酸性乳飲料感官評分標準Table 1 Sensory evaluation of acidic milk drinks

1.3.3 酸性乳飲料粒徑測定[8]

將酸性乳飲料水平放置在室溫中，測定儲藏0、1、5、10、15 d后的產品粒徑(volume mean diameter，D4,3)的變化，每次從底部吸取2 mL于激光粒度儀比色皿中，每個樣品自動重復測定3次。

1.3.4 酸性乳飲料Zeta電位[9]

基于經典動態(tài)光散射理論，用激光粒度儀Zeta potential模式測定在室溫中存放0、1、5、10、15 d后產品的電位，平衡時間為120 s，每個樣品進行3次測定。

1.3.5 酸性乳飲料流變性質測試

采用安東帕RheoCompass流變儀測定酸性乳飲料流變性，包括穩(wěn)態(tài)剪切和振蕩頻率掃描測試，每次測量之前，使樣品平衡2 min。所有試驗至少進行3次重復。

1.3.5.1 酸性乳飲料穩(wěn)態(tài)剪切測試[10]

測定表觀黏度隨剪切速率的變化。選用同軸圓筒，酸性乳飲料樣品剛好淹沒圓筒內劃線，轉子下降后樣品剛好覆蓋其表面。剪切速率0.001～10 s-1，溫度25 ℃，測定儲藏0、5、10、15 d后含不同穩(wěn)定劑的酸性乳飲料的黏度隨剪切速率的變化。

1.3.5.2 酸性乳飲料動態(tài)振蕩測試[11]

振幅掃描：固定頻率1 Hz，溫度25 ℃，在0.01%～100%進行應變掃描以確定線性黏彈區(qū)(linear viscoelastic region,LVR)。

由預實驗結果可知，為保證測定過程中所有果膠樣品均在線性黏彈區(qū)內，選擇1%作為應變掃描值。在溫度25 ℃，角頻率0.1～100 rad/s時進行頻率掃描測試。此試驗選擇直徑為40 mm的P50平板。記錄儲藏0、1、5、10、15 d后含不同穩(wěn)定劑的酸性乳飲料儲能模量G′和損耗模量G″的變化。

1.3.6 酸性乳飲料水分子流動性[12-13]

利用核磁共振分析儀測量酸性乳飲料存放1、7、14 d后的橫向弛豫時間T2。

測試條件：將裝有25 mL標準樣的玻璃試管(口徑2 cm)置于磁體線圈中(溫度32 ℃)，選擇FID序列，設置參數值。接收機帶寬SW=250 KHz，采樣起點RFD=0.080 ms，重復采用時間間隔TW=5 000.000 ms，90°和180°脈沖脈寬分別為P90=10.00 μs、P180=38.00 μs，量取25 mL測試樣品放入探頭內，使用CPMG序列測試，重復掃描次數NS=16，采樣點數TD=750 100，回波個數NECH=6 000，利用紐邁多指數反演軟件進行反演擬合，每個樣品測定3次。

1.3.7 酸性乳飲料R值的測定

分別測定貯藏前后飲料頂層乳濁液的透光率。取2 mL乳濁液于100 mL容量瓶中，加去離子水定容，在750 nm下測定其貯藏前后的透光率。用R值來衡量體系的穩(wěn)定性，R值按公式(2)計算[14]：

(2)

式中：R,飲料透光率變化；T1,貯藏0 d飲料頂層體系的透光率；T2,貯藏不同天數的飲料頂層體系的透光率。

1.4 統(tǒng)計分析

數據以均值±標準差表示，采用SPSS 21.0 對均值進行單因素ANOVA分析和最小顯著差數法(LSD)多重比較，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。采用Origin 8.5進行統(tǒng)計圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 不同穩(wěn)定劑使用量對酸性乳飲料沉淀率的影響

不同穩(wěn)定劑在添加量為0～0.5%對酸性乳飲料沉淀率的影響如圖1所示。穩(wěn)定劑種類及其用量對體系的穩(wěn)定性影響顯著(P<0.05)。當酸性乳飲料中不含穩(wěn)定劑時，沉淀率高，體系失穩(wěn)，酪蛋白發(fā)生聚集。隨著穩(wěn)定劑添加量的不斷增加，酸性乳飲料沉淀率先迅速下降后趨于平穩(wěn)，沉淀率出現平穩(wěn)趨勢時CMC、PGA及微波提取的果膠的添加量分別為0.4%、0.3%和0.3%，后期將以此添加量進行其他指標的考察。

圖1 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料沉淀率的影響Fig.1 Effects of different stabilizers on precipitation rate of acidic milk beverage

2.2 不同穩(wěn)定劑對酸乳飲料感官的影響

如表2所示，不同穩(wěn)定劑最佳使用量下對酸性乳飲料的感官差異顯著(P<0.05)。感官評分由高到低分別為：MAELP、CMC、PGA、空白組?？瞻捉M感官評分遠低于含穩(wěn)定劑組，主要是由于未添加穩(wěn)定劑的酸性乳飲料中酪蛋白在低于等電點的酸性條件下容易發(fā)生聚集沉淀，導致產品組織粗糙、不均勻、出現嚴重分層、沉淀現象；添加穩(wěn)定劑組中，果膠的酸性乳飲料感官評分最高，其次是CMC。

表2 穩(wěn)定劑對酸性乳飲料感官品質的影響(n=20)Table 2 Effect of stabilizers on sensory quality of acidic milk beverage

注：相鄰字母表示P<0.05；相間字母表示P<0.01。

2.3 不同穩(wěn)定劑對酸乳飲料粒徑的影響

產品的粒徑分布是影響粒子沉降速率的一個重要因素[15]。正常情況下，酸性乳飲料中酪蛋白的下沉速度與其粒子半徑成正比。半徑越小，分布越均勻，其下沉速度越慢，飲料的穩(wěn)定時間也就越長，乳液的穩(wěn)定性越好[16]。如表3所示，不同穩(wěn)定劑對產品粒徑有顯著差異(P<0.05)。粒徑由高到低分別為：空白>CMC>PGA>MAELP?？瞻捉M粒徑最大且隨存放時間的延長飲料分層出現破乳現象；相比果膠，CMC、PGA粒徑稍大，這可能由于果膠本身中性糖側鏈多，在乳飲料表面形成水合層產生空間位阻效應大，使得產品粒徑小[17]。此外，隨著儲存時間的延長，空白組粒徑不斷增加；添加穩(wěn)定劑的乳液粒徑變化不明顯，說明所有穩(wěn)定劑都具有較好的穩(wěn)定性，都能提高酸性乳飲料產品的穩(wěn)定性。在工業(yè)生產中，可以通過添加穩(wěn)定劑來降低乳液粒徑，提高產品的穩(wěn)定性。

表3 不同穩(wěn)定劑下酸性乳飲料粒度分布Table 3 Granularity distribution of acid milk beverage with different stabilizers

注：肩標小寫字母表示同列差異顯著P<0.05，大寫字母表示同行差異顯著P<0.05。下同。

2.4 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料電位的影響

Zeta電位是指帶電微粒表面剪切層的電位，由微粒表面電荷和周圍溶液環(huán)境條件共同決定，廣泛用于描述溶液微粒之間的靜電相互作用，是表征溶液體系穩(wěn)定性的重要指標[18]。如表4所示，不同穩(wěn)定劑產品Zeta電位絕對值由高到低依次為：MAELP、CMC、PGA、空白。酸性乳飲料pH值為3.8～4.2，低于酪蛋白的等電點4.6，空白組酪蛋白質膠粒帶正電，蛋白聚集沉淀，溶液Zeta電位小且為正[19]；添加CMC、PGA、果膠的產品的Zeta電位為負、絕對值高，這可能是由于帶負電荷的陰離子多糖因靜電吸附作用吸附在酪蛋白表面，酪蛋白“表觀”Zeta電位為負，具有靜電斥力和空間位阻作用，使酸性乳飲料具有一定穩(wěn)定性[20]。此外，隨著存放時間的增加，添加穩(wěn)定劑的產品Zeta電位的絕對值減小但差異不大，說明添加的穩(wěn)定劑都具有良好的穩(wěn)定性。不同穩(wěn)定劑對乳液Zeta電位差異顯著(P<0.05)，果膠產品比CMC、PGA產品電位高，這可能是由于果膠的帶電性質引起的，其羧基基團的負電荷與蛋白質的氨基基團發(fā)生的靜電交互作用比CMC、PGA強[21]。

表4 不同穩(wěn)定劑的酸性乳飲料在儲存過程產品Zeta電勢的變化Table 4 Zeta potential of milk beverage with different stabilizers during storage

2.5 酸乳飲料流變性

2.5.1 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料表觀黏度的影響

流變學特征作為表征乳飲料制品形態(tài)和穩(wěn)定特性的重要參數，體系黏度高可降低微粒的沉降速率，提高產品的穩(wěn)定性[10]。如圖2所示，所有產品的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，表現出剪切稀化行為，具有假塑性流體的性質。表觀黏度穩(wěn)定時，酸乳飲料表觀黏度由高到低依次為：MAELP、CMC、PGA、空白。果膠和CMC黏度較PGA大，這可能是由于與PGA相比，果膠和CMC的增稠作用更強，達到一定濃度后，能完全覆蓋在蛋白質表面，穩(wěn)定酸性乳體系中的蛋白質，使體系穩(wěn)定[11]。從圖3中看出，隨時間的延長，所有產品的表觀黏度都有所降低但不顯著，在存放過程中表觀黏度變化曲線均未出現上升拐點，表示產品未發(fā)生絮凝而導致黏度增加[22]。說明這幾種穩(wěn)定劑都具有良好的穩(wěn)定性，且其添加不會改變酸性乳飲料的剪切稀化特性。

圖2 不同穩(wěn)定劑對酸乳飲料表觀黏度的影響Fig.2 Effect of different stabilizers on apparent viscosity of acidic milk beverage

a-CMC表觀黏度;b-PGA表觀黏度;c-MAELP表觀黏度圖3 不同穩(wěn)定劑酸乳飲料表觀黏度變化圖Fig.3 Apparent viscosity charts of acid milk beverage with different stabilizers

2.5.2 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料頻率掃描的影響

酸性乳飲料的黏彈性可以通過動態(tài)流變學特性來描述，體系的動態(tài)黏彈性不僅能反應產品的實際穩(wěn)定性，同時還能表征穩(wěn)定劑與產品的相互作用。儲能模量(G′)表示樣品內部化學鍵數目和鍵能大小，損耗模量(G″)表示樣品內部因摩擦損失能量的大小[10]。圖4-a為CMC酸性乳飲料在存放過程G′和G″變化趨勢圖，G′和G″在存放時間內的變化無顯著差異，說明在存放過程中酸性乳飲料未發(fā)生改變，具有一定的穩(wěn)定性，且含其他穩(wěn)定劑的酸性乳飲料在存放過程中G′和G″的變化與此類似(未列出)。對含不同穩(wěn)定劑酸性乳飲料儲存0 d的G′和G″分析，結果如圖4-b、圖4-c所示，所有樣品G′和G″隨著角頻率的增加而增加，但大小有差異。損耗角正切值tanε為G″與G′比值，tanε越大，分子鏈段運動內耗越多，穩(wěn)定性越差，其可反應樣品體系的穩(wěn)定性[22]。

a-CMC產品G′和G″變化;b-產品G′變化;c-產品G″變化圖4 不同穩(wěn)定劑酸乳飲料頻率掃描圖Fig.4 Scanning pictures of frequency of acid milk drinks with different stabilizers

由圖5可知，添加穩(wěn)定劑的樣品較空白組tanε小，這可能是由于果膠、CMC、PGA是陰離子多糖，能通過氫鍵作用結合大量水，產品分子鏈纏繞較多，損耗正切值tanε小，具有長期貯藏穩(wěn)定性[23]，這一特性對于穩(wěn)定劑在乳飲料中的應用具有積極的作用。

圖5 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料損耗正切值的影響Fig.5 Effects of different stabilizers on tangent value of acid milk beverage

2.6 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料水分流動性的影響

核磁共振是一種優(yōu)良的評價食品品質的技術手段，檢測快速、靈敏、方便，被廣泛應用于生物體系中水分的研究。核磁共振技術主要以氫質子為研究對象，能表征水分子流動性的縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2[24]。橫向弛豫時間T2大小代表水分流動性的強弱，T2減小，意味著體系中的大分子與水分子結合緊密，水分子的流動性減弱，產品具有更好的穩(wěn)定性[12]，通常根據T2推斷水分子的結合力程度。

酸性乳飲料中質子弛豫時間的分布與樣品中水分的存在狀態(tài)及流動性密切相關。本實驗利用核磁共振分析儀CPMG序列測量酸性乳飲料體系中水分子流動情況，使用紐邁多指反演軟件反演所得的橫向弛豫時間T2和信號幅度。如圖6所示，所有樣品都有2個T2區(qū)間：T21(0.05～5 ms)、T22(100～1 000 ms)，其中0.05～5 ms的T21水分子可能是液體分子孔隙中所束縛的不易流動的水，也可能是與蛋白質等大分子表面極性基團緊密結合的水分子層，100～1 000 ms的T22可能表示樣品中大量自由水。在T2區(qū)間，空白組的產品曲線弛豫時間T2最大，PGA其次，果膠和CMC小，這可能是由于果膠和CMC的增稠作用較PGA強，產品的黏度更高，產品水分子流動性弱，穩(wěn)定作用強，影響了產品結合水和自由水之間的水[25]。將產品存放0、7、14 d后分別測定其水分流動性，如圖7所示，在存放過程中，空白組的乳飲料弛豫時間T2隨時間增加，信號幅度峰向右移動，T2增大，說明水分與其他組分結合的不緊密，樣品穩(wěn)定性差，而添加穩(wěn)定劑的乳飲料在存放過程中弛豫時間T2并未發(fā)生顯著性變化，只是信號強度略有改變，證明這幾種穩(wěn)定劑都具有很好的穩(wěn)定性。

圖6 不同穩(wěn)定劑酸乳飲料0 d橫向弛豫時間(T2)Fig.6 Transverse relaxation time(T2)distribution of acid milk with different stabilizers

a-空白(T2);b-CMC(T2);c-PGA(T2);d-MAELP(T2)圖7 穩(wěn)定劑酸乳飲料儲存過程中橫向弛豫時間(T2)Fig.7 Transverse relaxation time (T2)of acid milk beverage during storage of stabilizers

2.7 不同穩(wěn)定劑對酸性乳飲料R值的影響

R值大小可以更加直觀、形象地表征酸性乳飲料的穩(wěn)定性，實驗對存放90 d后的含不同穩(wěn)定劑的酸性乳飲料R值進行分析。由圖8可知，將貯藏0 d的飲料R值定義為100%，空白組R值在存放過程中變化較大，隨著存放時間的延長R值上升，這可能是由于在存放過程中出現分層現象，上層體系中大密度顆粒下沉；含不同穩(wěn)定劑的酸性乳飲料R值的改變程度不同，添加MAELP的飲料R值最大且在整個存放過程中變化最小(2.63%)，添加PGA產品R值最小但變化最大(4.16%)。與空白組相比，添加穩(wěn)定劑的酸性乳飲料的R值在存放過程中變化小，這可能是由于加入的穩(wěn)定劑與酪蛋白發(fā)生了締合，增加了分子的空間體積，能更有效地吸附蛋白質分子，增強了產品的穩(wěn)定性，R值變化再次從宏觀角度證明了這幾種穩(wěn)定劑具有很好的穩(wěn)定性。

圖8 不同穩(wěn)定劑對酸乳飲料R值的影響Fig.8 Influence of different stabilizer on R value of acid milk beverage

3 結論

(1)以沉淀率為指標，穩(wěn)定劑種類和用量對酸性乳飲料的穩(wěn)定性均有顯著影響(P<0.05)，果膠、CMC、PGA的最適用量分別為0.30%、0.40%、0.30%。

(2)穩(wěn)定劑對酸性乳飲料的穩(wěn)定作用在宏觀上表現為感官評分高、沉淀率降低、R值穩(wěn)定，在微觀性質上表現出產品的粒徑減小、水分流動性減弱、表觀黏度高、Zeta電位的絕對值升高。各指標隨存放時間增加未發(fā)生顯著性改變，幾種穩(wěn)定劑對酸性乳飲料都具有很好的穩(wěn)定作用，就整體穩(wěn)定效果而言，檸檬果膠的穩(wěn)定作用最好，其次是CMC。