楊亮，陳雙，徐巖*

1(茅臺學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷，564501)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

醬香型白酒是中國白酒工藝最為復(fù)雜和獨(dú)特的代表性產(chǎn)品，有關(guān)其酒體風(fēng)味的研究也受到科研領(lǐng)域的關(guān)注，如酒體風(fēng)味方法學(xué)研究、不同年份醬香型白酒主體風(fēng)味物質(zhì)、醬香型白酒特征性風(fēng)味物質(zhì)等[1-2]。

作為傳統(tǒng)釀造飲品的一種，醬香型白酒在釀造過程中不可避免地會產(chǎn)生一定量的缺陷酒，典型的8種缺陷風(fēng)味為泥臭味、鹽菜味、異味、泥味、餿味、泥霉味、霉味和煤油味。現(xiàn)階段，針對醬香型缺陷酒的研究較少，且學(xué)術(shù)界與醬香型酒企對缺陷風(fēng)味的描述有所區(qū)別[3]。如CHEN等[4]研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒的爛卷心菜、焦橡膠等異嗅來源是甲硫醇、乙硫醇等揮發(fā)性硫化物；DING等[5]鑒定了導(dǎo)致多種白酒(含醬香型白酒)呈現(xiàn)出動(dòng)物臭/皮毛臭的異嗅物質(zhì)為4-甲基苯酚。對醬香型缺陷酒研究的不足，一方面是由于科研人員缺乏行業(yè)背景，對醬香型缺陷酒的風(fēng)格把握不夠準(zhǔn)確，以及科研院所和企業(yè)對接溝通的屏障，無形中給缺陷酒的研究帶來障礙；另一方面，缺陷風(fēng)格有可能是由多種物質(zhì)相互作用引起，化合物相互作用影響風(fēng)味的表征，也給研究帶來了困難。

對于白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究方法，通常在風(fēng)味物質(zhì)提取的基礎(chǔ)上，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS)等技術(shù)[6-7]對化合物進(jìn)行定性或定量分析。其中的風(fēng)味物質(zhì)提取多采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)和頂空固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)兩種方法[8-9]，而這兩種方法提取物各有側(cè)重點(diǎn)，提取結(jié)果有一定差異。

本文針對尚未報(bào)道的醬香型鹽菜味缺陷酒，采用LLE和HS-SPME兩種前處理方法，通過GC-MS分析結(jié)合保留指數(shù)法，分析鹽菜味缺陷酒的風(fēng)味物質(zhì)，為后續(xù)研究提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

固相微萃取頭(DVB /CAR/PDMS)，加拿大Supelco公司；氣相色譜(GC 6890N)/質(zhì)譜(MS 5975)，美國Agilent公司；SPME自動(dòng)進(jìn)樣裝置，德國Gerstel公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.1.2 主要試劑

C5～C30烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醚、NaCl、Na2SO4(分析純)，上海國藥集團(tuán)；戊烷(色譜純)，購自德國CNW公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料

酒樣(醬香型鹽菜味缺陷酒)，由貴州茅臺鎮(zhèn)某酒廠提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LLE

參考WANG等[10]的方法，并作適當(dāng)調(diào)整。50 mL酒樣用煮沸過的超純水稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%，加NaCl直至飽和。50 mL重蒸的乙醚∶戊烷(1∶1)萃取3次。有機(jī)相記為萃取液1(Extract 1)。復(fù)合萃取液1將進(jìn)一步分離成酸性、水溶性、中性3部分。

用150 mL超純水和40 g NaCl加入到Extract 1中，以10% NaHCO3溶液調(diào)pH至10，靜置分層，然后用分液漏斗分離后保存。分液漏斗底部分離出來的記為“水相1”，從分液漏斗上部取出的記為“Extract 2”。在分液漏斗中用10 mL超純水洗Extract 2，有機(jī)相收集記為“Extract 3”?；旌鲜Ｓ嗨嗖糠趾汀八?”，混合水相在分液漏斗中用2 mol/L H2SO4調(diào)pH至2，再用25 mL重蒸乙醚萃取3次，乙醚萃取物添加10 g Na2SO4過夜干燥。萃取液氮吹濃縮至200 μL，濃縮液記為“酸性/水溶性組分”?！癊xtract 3”添加10 g Na2SO4過夜干燥后，氮吹濃縮至200 μL，記為“中性組分”。3種組分待GC-MS進(jìn)一步分析。

1.2.2 HS-SPME

將1 mL酒樣、4 mL超純水及1.5 g NaCl加入頂空瓶內(nèi)，迅速用帶特氟龍墊片的空心鐵蓋密封。密封后采用Gerstel MPS 2多功能自動(dòng)進(jìn)樣器對樣品進(jìn)行頂空固相微萃取。萃取條件：2 cm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，萃取溫度為40 ℃，樣品平衡5 min，吸附萃取40 min。萃取結(jié)束后萃取頭于GC進(jìn)樣口250 ℃解析附5 min，進(jìn)行GC-MS檢測分析。

1.2.3 GC-MS分析

GC條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純He，流速2 mL/min，進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣。DB-FFAP(60 m×0.25 mm × 0.25 μm)升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃，保持20 min。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度 230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500 amu。

1.2.4 定性分析

化合物經(jīng)過質(zhì)譜庫檢索與NIST 14(Agilent Technologies Inc.)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對初步定性。在酒樣相同的GC-MS分析條件下，對C5～C30正構(gòu)烷烴混標(biāo)分析，根據(jù)正構(gòu)烷烴中各烷烴的保留時(shí)間，根據(jù)改進(jìn)的Kovats法[11]計(jì)算初步定性的各化合物的保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)對比鑒定。

2 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用LLE及HS-SPME兩種前處理方法，對醬香型鹽菜味缺陷酒中的揮發(fā)性物質(zhì)做了定性研究，其中LLE萃取的物質(zhì)又細(xì)分為酸性組分、堿性組分和中性組分，圖1中a-d依次為這3種組分及HS-SPME的GC-MS檢測總離子色譜圖。

a-酸性組分；b-堿性組分；c-中性組分；d-HS-SPME組分圖1 LLE萃取組分及HS-SPME萃取的GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of ingredients extracted by LLE and HS-SPME

從圖1可以明顯看出，LLE前處理的3種組分中，萃取物質(zhì)種類含量依次為中性組分>酸性組分>堿性組分。但從離子圖較難辨別LLE檢測物質(zhì)種類與HS-SPME的區(qū)別，需通過質(zhì)譜庫及保留指數(shù)等方法進(jìn)一步分析。

經(jīng)質(zhì)譜庫及保留指數(shù)鑒定，HS-SPME檢出56種化合物，LLE檢出58種化合物，2種前處理方法檢出物質(zhì)中有38種重復(fù)，共檢出的76種物質(zhì)如表1所示。LLE的3種組分中，酸性組分19種，堿性組分7種，中性組分42種，其中有9種物質(zhì)在2種或3種組分中都有檢出，重復(fù)出現(xiàn)的物質(zhì)主要為醇類、呋喃類及含氮化合物。

表1 LLE、SPME萃取醬香型鹽菜味缺陷酒揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果Table 1 Compare GC-MS results of pickled mustard (Brassica juncea)like off-flavor liquor of maotai-flavor by LLE and SPME

續(xù)表1

序號名稱CasRI鑒定依據(jù)前處理方法SPMELLE香氣特征d39壬酸乙酯123-29-51507MS,RIL+果蜜味40dl-2-羥基己酸乙酯c6946-90-31510MS,RIL++-41甲酸辛酯112-32-31490MS+果味玫瑰42乳酸異戊酯19329-89-61642MS,RIL+果香奶油43丁二酸二乙酯c123-25-11711MS,RIL+熟蘋果44己酸己酯6378-65-01631MS,RIL+草本水果45癸酸乙酯c110-38-31601MS,RIL++蘋果46乙酸苯乙酯c103-45-71805MS,RIL++玫瑰水果47月桂酸乙酯c106-33-21864MS,RIL+肥皂48苯乙酸乙酯c101-97-31838MS,RIL++花香蜂蜜49丁酸苯乙酯103-52-61939MS,RIL+霉、果香50十四酸乙酯c124-06-12060MS,RIL++紫羅蘭51十五酸乙酯c41114-00-52159MS,RIL++蜜、甜5213-甲基-十四烷酸乙酯c100033-66-52105MS++-539-十五碳烯酸乙酯c56219-09-12148MS++-54軟脂酸乙酯c628-97-72245MS,RIL++乳脂香559-十六碳烯酸乙酯c54546-22-42254MS,RIL++-56油酸乙酯c111-62-62456MS,RIL++脂肪蠟味57反油酸乙酯c6114-18-72436MS,RIL++-酚類58愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)ac90-05-11845MS,RIL+煙熏594-乙基苯酚c123-07-92160MS,RIL+酚、煙熏602,4-二叔丁基苯酚c96-76-42322MS,RIL++酚味內(nèi)酯類61γ-丁內(nèi)酯c96-48-01669MS,RIL+奶油62γ-壬內(nèi)酯c104-61-02066MS,RIL+椰子,桃63(Z)-Oxacyclopentadec-6-en-2-onec63958-52-12034MS++-呋喃類64糠醛bc98-01-11440MS,RIL++甜、杏仁655-甲基呋喃醛ac620-02-01528MS,RIL+焦糖665-甲基-2-乙?；秽玞1193-79-91677MS,RIL+霉堅(jiān)果67糠醇abc98-00-01648MS,RIL++霉、焦糖682,2-亞甲基雙呋喃1197-40-61627MS,RIL+烘烤含氮化合物692,3-二甲基吡嗪bc5910-89-41351MS,RIL++烤堅(jiān)果702-乙基-6-甲基吡嗪c13925-03-61354MS,RIL+烤土豆712,3,5,6-四甲基吡嗪abc1124-11-41426MS,RIL++堅(jiān)果、霉722-乙?；量ヽ1072-83-91930MS,RIL+霉、果香含硫化合物73二甲基三硫c3658-80-81438MS,RIL++硫、洋蔥烴類及其他74(2,2-二乙氧基乙基)苯a6314-97-21714MS,RIL++花香752,5-二甲氧基甲苯24599-58-41812MS,RIL+-764-烯丙基-1,2-亞甲基二氧基苯94-59-71915MS,RIL+香醇、木

注：“+”：檢測出此物質(zhì)；a：LLE酸性組分中檢出；b：LLE堿性組分中檢出；c：LLE中性組分中檢出；d:通過文獻(xiàn)查閱的化合物的香氣特征。

圖2 LLE、SPME萃取香氣物質(zhì)種類數(shù)量比較Fig.2 Compare the variety of LLE,SPME extraction of aroma compounds

酯類化合物是2種前處理方式檢測出的種類最多的化合物，共31種，其次為酸類、醇類和醛酮類，依次有10種、9種和7種。檢測出的丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、苯乙醇等化合物以及硫化物二甲基三硫被認(rèn)為是醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)中最有效的幾種香味物質(zhì)[13]。

揮發(fā)性酚類化合物[14]和含硫化合物[15-16]多為底閾值化合物，對醬香型白酒風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。酒體中的呋喃類化合物主要貢獻(xiàn)焦糖和烤焦的香[17-18]，內(nèi)酯類多有椰子、奶油、桃香等風(fēng)味[19]，而由糖和氨基酸殘基之間的美拉德反應(yīng)或微生物代謝產(chǎn)生含氮化合物，如吡嗪等，主要貢獻(xiàn)烘烤香[20-21]。其中分別具有酚類氣味和烘烤氣味的風(fēng)味物質(zhì)2,4-二叔丁基苯酚和2,2-亞甲基雙呋喃在白酒中首次報(bào)道。檢出的76種化合物，未發(fā)現(xiàn)具有典型鹽菜味的物質(zhì)，原因主要有以下兩點(diǎn)：一方面，儀器掃描靈敏度限制了化合物的全面挖掘，一些含量較低但閾值較高的化合物未被檢測出；另一方面，鹽菜味缺陷或許并非由單一物質(zhì)引起，而是由多種化合物相互作用以表征出此風(fēng)味。

綜上所述，結(jié)合使用LLE和HS-SPME兩種方法提取鹽菜味缺陷酒風(fēng)味物質(zhì)后，再通過GC-MS分析，并采用保留指數(shù)驗(yàn)證，可更全面地檢測出鹽菜味缺陷酒的主體風(fēng)味物質(zhì)，而鹽菜味的特征異嗅物質(zhì)的鑒定及風(fēng)味物質(zhì)間的相互作用關(guān)系，有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS法首次分析了醬香型鹽菜味缺陷酒的風(fēng)味物質(zhì)，并采用LLE和HS-SPME兩種方法對酒樣進(jìn)行前處理，彌補(bǔ)了2種前處理方法在鑒定物質(zhì)方面的傾向性的不足，檢測的酒體風(fēng)味物質(zhì)的更加全面。對醬香型鹽菜味缺陷酒的風(fēng)味物質(zhì)的組成進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。