胡正霞，何東升，涂家生

(中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

基因治療是指通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源治療基因?qū)氩∽兊陌屑?xì)胞中，調(diào)控目的基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)糾正或補(bǔ)償缺陷基因，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，恢復(fù)組織或器官的正常功能，從而達(dá)到治療目的。基因治療需要將治療基因有效地遞送至靶細(xì)胞內(nèi)，因此其關(guān)鍵在于高效、安全的基因載體[1]。

目前常用的基因載體主要有病毒載體(viral vector)和非病毒載體(non-viral vector)。盡管病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)基因效率，但因其自身潛在的免疫原性、載體容量小、不易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)、制備復(fù)雜及成本昂貴等，限制了病毒載體的應(yīng)用。與病毒載體相比，非病毒載體基因遞送效率相對(duì)較低，但有望克服病毒載體的一些局限性，具有低細(xì)胞毒性、低免疫原性、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，但在臨床應(yīng)用上仍存在許多待解決的難題。理想的非病毒基因載體應(yīng)當(dāng)：①與核酸形成穩(wěn)定性好且粒徑合適的復(fù)合物，免受核酸酶的降解和機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除；②具有表面保護(hù)功能域，避免與血漿蛋白相互作用，介導(dǎo)有效且有選擇性地細(xì)胞攝?。虎塾行У貜募?xì)胞內(nèi)涵體、溶酶體逃逸；④細(xì)胞內(nèi)定位[2]。

常見(jiàn)的非病毒基因載體主要包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationic liposome)、陽(yáng)離子聚合物(cationic polymer，如樹狀大分子、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺等)、肽類和無(wú)機(jī)納米粒子等。其中，樹狀大分子(dendrimer)因其結(jié)構(gòu)精確、高度枝化、具有三維球形結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。

1 樹狀大分子

“Dendrimer”一詞源于希臘語(yǔ)“dendron”(樹)和“meros”(部分)，最初由V?gtle課題組在20世紀(jì)70年代末報(bào)道，此后由Tomalia、Newkome和其他研究者進(jìn)一步發(fā)展，產(chǎn)生了多樣的樹枝狀結(jié)構(gòu)[3]。樹狀大分子由中心核(core)、中間重復(fù)單元(interior)和末端基團(tuán)(exterior)3部分構(gòu)成，具有高度的幾何對(duì)稱性[4]。陽(yáng)離子樹狀大分子，如聚酰胺-胺樹狀大分子(PAMAM)、聚(丙烯亞胺)樹狀大分子(PPI)、聚(L-賴氨酸)樹狀大分子(PLL)、三嗪樹狀大分子、碳硅烷樹狀大分子、聚(亞胺)樹狀大分子(PETIM)、含磷樹狀大分子和紫腈樹狀大分子[5]，因具有良好的單分散性、可控的分子結(jié)構(gòu)、高密度且數(shù)目精確的多個(gè)表面功能基團(tuán)，已經(jīng)成為核酸遞送的重要載體。陽(yáng)離子樹狀大分子通過(guò)靜電作用與核酸結(jié)合形成復(fù)合物，保護(hù)核酸免受降解，并幫助細(xì)胞內(nèi)化作用[3]。陽(yáng)離子樹狀大分子的基因轉(zhuǎn)染效率較強(qiáng)，自身具有一定的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，可實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)涵體、溶酶體逃逸。但研究表明，樹狀大分子的細(xì)胞毒性隨其分子量和電荷密度的增加而增大，即代數(shù)越高，分子量越大，轉(zhuǎn)染能力較強(qiáng)，但其細(xì)胞毒性也隨之增加。因此，在陽(yáng)離子樹狀大分子用于基因遞送方面，維持高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)降低細(xì)胞毒性至關(guān)重要[6]。

2 樹狀大分子的基因遞送策略

基于早期對(duì)樹狀大分子代數(shù)(G1～G10)、種類(如PAMAM、PPI、聚賴氨酸)的研究，目前的研究集中于表面功能基團(tuán)[5]、中心核[7]、樹狀大分子結(jié)構(gòu)的修飾和低代樹狀大分子的組裝[6]，以克服基因遞送過(guò)程中的多重障礙，同時(shí)增加其生物相容性。

2.1 表面功能基團(tuán)的修飾 樹狀大分子外周的多種功能基團(tuán)為其表面修飾提供了理想的位點(diǎn)，研究人員使用了包括氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氟化物、糖類、聚合物和納米粒等功能基團(tuán)對(duì)樹枝狀大分子進(jìn)行修飾[5]。這些修飾的主要目的是調(diào)節(jié)樹狀大分子表面電荷和疏水性。適量的表面電荷密度有助于復(fù)合物的形成、細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸，但過(guò)量的正電荷會(huì)造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。為了降低細(xì)胞毒性，可通過(guò)引入屏蔽基團(tuán)以降低表面電荷密度。

Fant等[8]研究了一系列PEG化和乙?；腜AMAM樹狀大分子，結(jié)果表明，樹狀大分子的PEG化明顯降低了自身的細(xì)胞毒性，并且增加了血液循環(huán)時(shí)間。然而，PEG化或乙酰化的程度與轉(zhuǎn)染效率直接相關(guān)。較高程度的PEG化減少了表面電荷，可能會(huì)降低核酸的壓縮能力、細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染效率。

Choi等[9]將L-精氨酸和L-賴氨酸分別連接到PAMAM樹狀大分子表面，與未修飾的樹狀大分子相比，L-精氨酸修飾PAMAM樹狀大分子具有更好的DNA的壓縮、復(fù)合能力和更高的轉(zhuǎn)染效率。Yu等[10]在G4.0 PAMAM樹狀大分子外周修飾帶有咪唑基團(tuán)的組氨酸和精氨酸，咪唑基團(tuán)在內(nèi)涵體、溶酶體的pH條件下能夠質(zhì)子化，顯著提高了樹狀大分子的質(zhì)子緩沖能力，促進(jìn)了復(fù)合物從內(nèi)涵體的逃逸，在多個(gè)細(xì)胞系中都表現(xiàn)出了較好的轉(zhuǎn)染效率。相似地，通過(guò)胍基[11]、咪唑基團(tuán)[12]、多胺[13]、PEI聚合物[14]的修飾，樹枝狀大分子的轉(zhuǎn)染效率能夠顯著增加。

樹狀大分子表面修飾的另一個(gè)重要作用是賦予載體多種功能，如進(jìn)行核酸的靶向遞送，即通過(guò)在樹狀大分子結(jié)構(gòu)上引入靶頭以實(shí)現(xiàn)靶向作用，如生物素、葉酸、多肽(如靶向整合素受體的RGD多肽，腦靶向的RVG29肽、angiopeptide和T7肽，以及腫瘤酸性靶向的低pH插入肽(pHLIP)、蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)、糖類(如乳糖、半乳糖)[2]。此外，選擇不同種類的多肽或者糖類修飾樹狀大分子，能夠制備不同功能的載體。Arima等[15]在PAMAM樹狀大分子表面分別連接α、β和 γ 環(huán)糊精，顯著提高了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，這可能與提高與細(xì)胞膜的親和能力，改變pDNA的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。環(huán)糊精-PAMAM樹狀大分子連接靶向多糖在基因遞送中能夠產(chǎn)生協(xié)同作用。多肽修飾方面，細(xì)胞穿膜肽能夠增強(qiáng)細(xì)胞攝取，例如TAT和R9[2]；核定位信號(hào)多肽能夠介導(dǎo)細(xì)胞核的進(jìn)入，如SV40大T抗原的核定位信號(hào)[16]。這一類多肽修飾PAMAM樹狀大分子有助于增強(qiáng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用[2]。

樹狀大分子的表面修飾也包括用納米粒(如碳納米管、石墨烯、量子點(diǎn))和其他功能性配體(如光敏劑)修飾[5]，這些經(jīng)過(guò)表面修飾的樹狀大分子在基因的體內(nèi)外遞送中都具有可觀的應(yīng)用前景。

2.2 中心核的修飾 樹狀大分子的中心核直接影響外周功能基團(tuán)的數(shù)目、分子大小、形狀和整體結(jié)構(gòu)，更重要的是影響樹狀大分子的柔韌性和強(qiáng)度[17]。在核酸的遞送過(guò)程中，將核酸有效壓縮成穩(wěn)定的復(fù)合物是關(guān)鍵，因此，樹狀大分子的柔性至關(guān)重要。改變中心核的分支單元可以調(diào)節(jié)樹狀大分子柔性。Zhang等[18]以三甲基-1,3,5-苯三甲酸、季戊四醇和肌醇為中心核合成的一系列不同代數(shù)的PAMAM樹狀大分子分別往三、四、六個(gè)方向生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)，在這些樹狀大分子中，柔性最好的是以三甲酸酯為核心的六代樹狀大分子，在體外表現(xiàn)出最好的DNA壓縮能力和最高的轉(zhuǎn)染效率。

圖1 以三甲基-1,3,5-苯三甲酸(A)、季戊四醇(B)和肌醇(C)為核心的G3.0樹狀大分子[18]

通過(guò)不同的方式對(duì)中心核進(jìn)行修飾可調(diào)節(jié)樹狀大分子的疏水性。Chang等[19]系統(tǒng)地比較了以乙二胺、己二胺和二氨基十二烷為中心核的PAMAM樹狀大分子在基因遞送中的作用，結(jié)果表明，以二氨基十二烷為中心核的PAMAM樹狀大分子在保持傳統(tǒng)PAMAM樹狀大分子固有的DNA壓縮能力、生物相容性、內(nèi)涵體逃逸能力的同時(shí)，具有最高的轉(zhuǎn)染效率和最低的細(xì)胞毒性。引入疏水烷基鏈作為中心核促進(jìn)了載體/基因復(fù)合物的內(nèi)化作用，增加了復(fù)合物的細(xì)胞攝取。

樹狀大分子的表面修飾能夠使其具備多種功能，中心核的調(diào)節(jié)也能夠產(chǎn)生新功能。早期的表面修飾策略，如引入光敏劑、環(huán)糊精和PEG已經(jīng)被用于修飾樹狀大分子的中心核。Ma等[20]以卟啉為中心核，合成了表面功能化的聚(L-賴氨酸)樹狀大分子(見(jiàn)圖2)，卟啉本身即作為光敏劑，這種光化學(xué)內(nèi)化效應(yīng)使其在不同細(xì)胞系中都呈現(xiàn)出光響應(yīng)的基因表達(dá)。Liang等[21]合成了以β-環(huán)糊精為中心核的PAMAM樹狀大分子(見(jiàn)圖3)，在基因遞送過(guò)程中呈現(xiàn)出良好的生物相容性、相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率。樹狀大分子核心的環(huán)糊精改善了樹狀大分子-基因復(fù)合物的血清穩(wěn)定性，并降低了對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性。Albertazzi等[22]以PEG為核心，分別合成了兩分支、四分支不同代數(shù)的樹狀大分子，四分支的樹狀大分子較兩分支具有更好的DNA復(fù)合能力和更高的轉(zhuǎn)染效率，此外以PEG為核心的樹狀大分子對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞均具有很低的毒性。

2.3 低代樹狀大分子的組裝 基于高代樹狀大分子雖具有高轉(zhuǎn)染效率但細(xì)胞毒性大，低代樹狀大分子盡管細(xì)胞毒性小但轉(zhuǎn)染效率低的現(xiàn)狀，研究者們提出了將低代樹狀大分子組裝成帶一定正電荷的納米結(jié)構(gòu)，形成穩(wěn)定復(fù)合物和響應(yīng)性分解的策略，以實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)染的同時(shí)降低細(xì)胞毒性[6]。

低代樹狀大分子可以通過(guò)超分子策略制備成納米結(jié)構(gòu)，在水溶液中通過(guò)離子作用、氫鍵、疏水作用、親氟作用，樹狀大分子間相互連接。Liu等[23]在二代PAMAM樹狀大分子表面修飾一定數(shù)量的苯基硼酸，苯基硼酸與伯胺基通過(guò)離子相互作用，形成粒徑約100 nm的納米顆粒(見(jiàn)圖4)。該納米結(jié)構(gòu)較G5.0樹狀大分子具有更好的DNA和siRNA遞送效率，且與Lipofectamine 2000相當(dāng)。更重要的是在酸性條件下，其能夠快速解體為低代樹狀大分子，因而對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性低。當(dāng)?shù)头肿恿康臉渲εc脂肪鏈通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)、原位合成或主客體相互作用共價(jià)結(jié)合后，生成的兩親性聚合物通過(guò)疏水作用能夠自組裝成納米結(jié)構(gòu)。分子中脂肪鏈決定納米結(jié)構(gòu)的樹枝數(shù)目、粒徑和電荷密度，而樹枝則與DNA的結(jié)合和內(nèi)涵體逃逸能力相關(guān)。Yu等[24]將十八碳的疏水脂肪鏈通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與親水的PAMAM低代樹枝共價(jià)連接，形成兩親性樹狀大分子(見(jiàn)圖5)，用于遞送Hsp27 siRNA，在去勢(shì)抵抗性前列腺癌模型中具有顯著的基因沉默和抗癌活性。脂肪鏈的數(shù)目、長(zhǎng)度和飽和度均會(huì)影響DNA的壓縮能力和載體基因復(fù)合物的粒徑。除了脂肪鏈，疏水性的膽固醇與低分子量的樹枝結(jié)合也能生成兩親性的聚合物用于基因遞送。膽固醇的耐受性良好，Jones等[25]合成了以膽固醇為核心、末端為精胺的樹枝，能夠自組裝成納米結(jié)構(gòu)，通過(guò)膽固醇與細(xì)胞膜磷脂的相互作用擾亂內(nèi)涵體膜，促進(jìn)復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸。

脂肪鏈和膽固醇修飾的樹枝或樹狀大分子在水溶液中穩(wěn)定性良好，但當(dāng)其穿過(guò)細(xì)胞膜后，會(huì)因細(xì)胞膜磷脂的影響導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。因此，有研究者提出用氟代烷基鏈取代超分子兩親性化合物中的脂肪鏈或膽固醇。氟代烷基鏈?zhǔn)杷沂柚?，碳氟鏈在親水和疏水的環(huán)境中通過(guò)親氟效應(yīng)相互結(jié)合。Wang等[26]用七氟丁酸對(duì)G1.0和G2.0 PAMAM樹狀大分子進(jìn)行修飾，組裝成與病毒大小相似的納米顆粒。通過(guò)調(diào)整表面七氟丁酸的數(shù)目以控制整體結(jié)構(gòu)，增加七氟丁酸數(shù)目，就能在極低N/P比下實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率，最有效的結(jié)構(gòu)自組裝在20 ng超低DNA劑量下就能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高轉(zhuǎn)染效率，即使在50%血清存在下也能維持高效轉(zhuǎn)染，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明能夠有效轉(zhuǎn)染3D球和實(shí)體瘤。氟原子的引入使得較短碳鏈就能夠與12～18碳的脂肪鏈產(chǎn)生相同的基因遞送效率，此外，碳氟鏈通過(guò)“氟效應(yīng)”(增加血清抗性、細(xì)胞攝取、內(nèi)涵體逃逸和有利于細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放)提高了陽(yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率[6]。

圖2 以卟啉為中心核的樹狀大分子[20]

圖3 以β-環(huán)糊精為中心核的PAMAM樹狀大分子[21]

圖4 G2.0 PAMAM樹狀大分子表面修飾苯基硼酸后形成pH敏感的納米簇[23]

圖5 疏水部分為十八碳烷基鏈，親水部分為G3.0 PAMAM樹枝的兩親性樹狀大分子[24]

低代樹狀大分子通過(guò)刺激響應(yīng)型化學(xué)鍵與生物相容性的納米粒、蛋白質(zhì)或聚合物連接，暫時(shí)生成具有相對(duì)高電荷密度的雜交材料，實(shí)現(xiàn)高效且無(wú)毒的基因遞送。Xu等[27]將以硫辛酸為核心的低代多肽樹枝通過(guò)共價(jià)鍵連接到無(wú)機(jī)納米粒子量子點(diǎn)表面，生成多功能的超分子雜交樹狀大分子，其基因轉(zhuǎn)染效率約為單個(gè)多肽樹枝的50 000倍。樹枝與無(wú)機(jī)納米粒通過(guò)Au-S鍵連接，細(xì)胞內(nèi)吞后在胞內(nèi)谷胱甘肽作用下，化學(xué)鍵斷裂，因而在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中呈現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性。無(wú)機(jī)納米粒(金、氧化鐵、量子點(diǎn)等)的引入賦予雜交基因載體新功能，如金納米?？捎糜赬射線計(jì)算機(jī)斷層掃描或組合光熱治療，氧化鐵納米?？捎糜诖殴舱癯上瘢孔狱c(diǎn)可用于熒光成像[6]。

低分子量的樹狀大分子通過(guò)共價(jià)鍵交聯(lián)形成更大的納米簇能夠改善基因轉(zhuǎn)染。Liu等[28]將G2.0 PAMAM樹狀大分子通過(guò)二硫鍵彼此交聯(lián)，該納米結(jié)構(gòu)能夠?qū)NA壓縮形成約200 nm的復(fù)合物，細(xì)胞攝取后二硫鍵斷裂分解成彼此獨(dú)立的G2.0樹狀大分子，具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。Jia等[29]將苯基硼酸修飾的低分子量超支化低聚乙烯亞胺通過(guò)硼酸-二醇鍵與富含1,3-二醇的超支化聚甘油反應(yīng)，生成相對(duì)高電荷密度的動(dòng)態(tài)可逆納米簇(見(jiàn)圖6)。與低分子量的低聚乙烯亞胺相比，該納米簇與siRNA的親和力強(qiáng)，在溶酶體酸性環(huán)境中分解，細(xì)胞毒性小。除此之外，超支化的聚甘油疏水內(nèi)部可用于載抗癌藥物如阿霉素，用于癌癥的協(xié)同治療。

圖6 通過(guò)低分子量超支化聚合物表面官能團(tuán)的共價(jià)鍵連接，自組裝成pH敏感的納米簇[6]

3 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用樹狀大分子作為基因載體的研究已經(jīng)長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，盡管有商品化的基因轉(zhuǎn)染試劑SuperfectTM和 PrioFectTM，但其在臨床應(yīng)用上依然面臨重重困難。高代數(shù)的樹狀大分子雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但價(jià)格昂貴且細(xì)胞毒性大，因此構(gòu)建高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性的樹狀大分子是進(jìn)一步拓展其應(yīng)用的關(guān)鍵。研究者們通過(guò)對(duì)樹狀大分子的外周官能團(tuán)修飾、中心核修飾和低代樹狀大分子的組裝等，已經(jīng)取得了很多突破性的進(jìn)展，為臨床應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。