韓肖驊 馬保金

(復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一,全球每年新增病例約150萬,嚴重危害女性的健康。早期乳腺癌預后較好,而晚期乳腺癌發(fā)生淋巴結轉移和血性轉移,預后往往較差,因此早診斷、早治療可提高乳腺癌療效及改善預后[1]?；罱M織檢測有侵入性,且存在一定的取樣誤差,患者依從性不高。由于乳腺癌缺乏敏感的生物標記物,簡便易行的乳腺癌早期診斷指標仍在探尋中。隨著對腫瘤機制的研究越來越深入,微小RNA(miRNA)已經成為新型基因水平的腫瘤標記物,可用于腫瘤精確診斷,但組織標本獲取有侵入性,限制了其在臨床的應用[2]。血清miRNA相對較易獲得,并且穩(wěn)定性較好,在反復凍融、酸堿和煮沸等惡劣環(huán)境下不易降解,故循環(huán)miRNA受到越來越多的關注[3]。本研究通過檢測血清miR-141和 miR-195-5p,觀察其與臨床指標、增殖和遷移的相關性,并評估其在乳腺癌早期診斷中的價值。

資料和方法

臨床資料選擇2015年1月至2018年6月在復旦大學附屬華山醫(yī)院診斷為乳腺癌的患者126例,作為乳腺癌組,平均年齡(52.37±6.37)歲(35～79歲);術后病理TNM分期:Ⅰ期22例,Ⅱ期43例,Ⅲ期50例和Ⅳ期11例;組織分級:Ⅰ級25例,Ⅱ級57例和Ⅲ級44例。選擇同期在我院活組織檢測為乳房良性病變患者75例,作為良性病變組,平均年齡(53.19±7.19)歲(45～76歲);選擇同期在我院行健康體檢者45例,為健康對照組,平均年齡(52.49±7.16)歲(45～73歲)。納入標準:健康對照組和乳腺良性病變組無合并其他腫瘤;乳腺癌患者術前未行化療、放療等其他治療(其中包括11例Ⅳ期術前不愿接受化療和放療的患者);所有患者均簽訂知情同意書。排除標準:非乳腺癌;肝炎、結核和急性肺炎等急慢性感染;臟器功能不全(如肝臟、腎臟和肺等);有疾病相關用藥史。各組一般資料差異無統(tǒng)計學意義,各組比較的基線相同。

血液標本的抽取來院第1天和手術后1周抽取空腹肘靜脈血約5 mL,室溫靜置20 min,3 000 r/min離心10 min (離心半徑15 cm),分離出血清約3 mL,-80 ℃保存待檢測。

血清miR-141和 miR-195-5p的檢測采用苯酚氯仿法提取血清RNA。按照說明書進行miRNA的逆轉錄反應,其引物由上海昕浩生物合成。miRNA-141引物序列,正向:5’-ACACTCCAGCTGGGC-ATCTTCCAGTACAGT-3’,反向5’-CTCAACT-GGTGTCGTGGAGTCGCCAATTCAGTTGAGT-CCAACAC-3’;miR-195-5p引物序列,正向:5’-G-ATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’,反向:5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAAGT-3’;以U6作為內參的引物序列,正向:CTCGCTTCGGCAG-CACA,反向:AACGCTTCACGAATTT-GCGT。qRT-PCR的總反應體系為20 μL,主要組成為MgCl21.2 μL,PCR緩沖液2 μL,dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL,Taq酶0.3 μL,ddH2O 14.77 μL,探針和引物共0.33 μL,cDNA 1 μL。循環(huán)參數:95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔,并以DEPC處理的ddH2O為陰性對照。檢測結束后采用SDS2.0軟件分析獲得Ct值(圖1)。并用前期合成iRNA的cDNA 1 μmmol/L,按10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋后作為標準品,以濃度的對數為X軸,對應每個濃度的Ct值為Y軸,繪制成標準曲線,根據Ct值通過標準曲線計算出miR-141和 miR-195-5p的絕對濃度。

圖1 miR-141 (A)和miR-195-5p (B)的溶解曲線Fig 1 Dissolution curves of miR-141 (A) and miR-195-5p (B)

慢性病毒轉染構建對人乳腺癌細胞MX-1進行慢病毒包裝,取對數生長期MX-1細胞與250 μL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基和0.5 μg PMD2.G包裝載體加入到3支1.5 mL無菌Eppendorf管中,分別加入1.5 μg miR-141、 miR-195-5p全長載體和相應的空白載體,另取無菌Eppendorf管加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基,并與20 μL轉染脂質體混合,室溫靜置20 min,胰蛋白酶消化,將細胞稀釋至1×106/L,取1 mL細胞懸液,接種于6孔板,加入DNA和脂質體,培養(yǎng)過夜后更換培養(yǎng)液,48和72 h后分別收集病毒懸液并過濾。病毒懸液和10%DMEM培養(yǎng)基按1∶1混合后培養(yǎng)MX-1細胞3天,篩選出細胞株,轉染miR-141和 miR-195-5p全長載體的分別為miR-141組和 miR-195-5p組,轉染空白載體的為對照組。

細胞增殖能力檢測胰酶消化的MX-1細胞以2×106/L接種于96孔板,檢測時間點為0、24、48和72 h,CKK-8試劑與10%DMEM高糖培養(yǎng)液1∶9混合培養(yǎng)細胞1 h,檢測波長為450 nm,以各時點的吸光度(D)值與D0值(0 h時)的比值衡量細胞的相對增殖能力。

細胞遷移能力檢測無血清DMEM高糖培養(yǎng)液按1∶8稀釋Matrigel基質膠,共200 μL。取3只Transwell小室放置于24孔板中,遷移細胞密度調整為1×106/L,下室放置700 μL含10% FBS的高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后用10%甲醛固定細胞20 min,上室加入0.5%結晶紫溶液50 μL,拍照。用棉簽擦去上室未穿出的細胞,200倍光鏡下計數,取四周及中央5個視野,求平均值。

觀察指標觀察各組血清miR-141和miR-195-5p水平變化,乳腺癌患者術后血清miR-141和miR-195-5p水平變化,乳腺癌患者血清miR-141和miR-195-5p水平與臨床指標、增殖和遷移的相關性,及其診斷乳腺癌的靈敏度和特異性。

結 果

各組血清miR-141和miR-195-5p水平比較血清miR-141水平:乳腺癌組顯著高于良性病變組和健康對照組(P<0.01),良性病變組較健康對照組顯著升高(P<0.01);血清miR-195-5p水平:乳腺癌組明顯低于良性病變組和健康對照組(P<0.01),良性病變組較健康對照組明顯降低(P<0.01)(表1,圖2)。

表1 各組血清miR-141和miR-195-5p水平比較Tab 1 Comparison of serum miR-141 and miR-195-5p levels in different groups

(1)vs.control group,P<0.01;(2)vs.benign lesions group,P<0.01.

良性病變組和乳腺癌組術后血清miR-141和miR-195-5p水平表達乳腺癌組術后血清miR-141水平為(1.37±0.57) fmol/L,明顯低于術前的(8.22±2.19) fmol/L(t=33.978,P<0.01);乳腺癌組術后血清miR-195-5p水平為(5.77±1.62) fmol/L,明顯高于術前的(2.20±0.84) fmol/L (t=21.960,P<0.01)。乳腺良性病組術后血清miR-141水平為(1.25±0.86) fmol/L,明顯低于術前的(4.43±1.98) fmol/L(t=12.867,P<0.01);乳腺良性病組術后血清miR-195-5p水平為(6.26±1.86) fmol/L,明顯高于術前的(4.93±1.88) fmol/L (t=4.355,P<0.01)。

乳腺癌患者血清miR-141和miR-195-5p水平與臨床參數的關系乳腺癌組血清miR-141和miR-195-5p水平與年齡和腫瘤直徑無明顯相關性,而與淋巴結轉移、雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesteron receptor,PR)、人類表皮因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)、TNM分期、分子分型和組織分型具有明顯的相關性(P<0.01,表2),通過多元線性回歸發(fā)現,血清miR-141和miR-195-5p水平與淋巴結轉移、PR、TNM分期和分子分型呈線性相關(P<0.05,表3)。

(1)vs.control group,P<0.01;(2)vs.benign lesions group,P<0.01.
圖2 各組血清miR-141(A)和miR-195-5p(B)表達的比較
Fig 2 Comparison of serum miR-141 (A) and miR-195-5p (B) expressions in different groups

表2 乳腺癌臨床病例參數與血清miR-141和miR-195-5p表達的關系Tab 2 Relationship between clinical indexes of breast cancer and expression of serum miR-141 and miR-195-5p

ER:Estrogen receptor;PR:Progesteron receptor;HER-2:Human epidermal growth factor receptor 2.

表3 血清miR-141和miR-195-5p表達水平與臨床指標的多元線性回歸分析Tab 3 Multiple linear regression analysis between serum miR-141 and miR-195-5p expression levels and clinical indicators

各組乳腺癌細胞在各時點相對增殖能力和遷移能力的比較乳腺癌細胞轉染miR-141和miR-195-5p質粒后,與對照組比較,隨著培養(yǎng)時間的延長,miR-141組增殖能力明顯升高,而miR-195-5p組增殖能力明顯降低(表4)。各組培養(yǎng)24 h后,通過Transwell遷移實驗在200倍光鏡下(圖3)發(fā)現,對照組下室細胞數為(76.37±10.55)個,miR-141組下室細胞數為(138.34±15.67)個,miR-195-5p組下室細胞數為(65.46±9.42)個,miR-141組細胞遷移能力明顯高于對照組(P<0.01),而miR-195-5p組遷移能力明顯低于對照組(P<0.01)。

表4 各組在不同時點增殖能力的比較Tab 4 Comparison of proliferation ability in each group at different time points

圖3 細胞培養(yǎng)24 h后上室細胞的光鏡觀察(×200)Fig 3 Light microscopic observation of the upper chamber cells after 24 h of cell culture (×200)

乳腺良性病變與乳腺癌的ROC曲線分析以血清miR-141 (x1)和miR-195-5p (x2)水平根據乳腺良性疾病是否合并乳腺癌進行二元回歸得出方程:y=1.093x1-1.886x2-0.245,代入方程后得出聯(lián)合檢測(miR-141+miR-195-5p)變量。以聯(lián)合檢測作為檢驗變量,以發(fā)生乳腺癌為狀態(tài)變量繪制ROC曲線(圖4)。聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的靈敏度為88.1%,特異性為92.0%,AUC為0.964。聯(lián)合檢測的AUC明顯優(yōu)于miR-141(Z=3.413,P<0.01)和miR-195-5p(Z=3.426,P<0.01)單獨檢測,而血清miR-141和miR-195-5p的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 miR-141和miR-195-5p對乳腺癌的診斷效能比較Tab 5 Diagnostic efficacy of miR-141 and miR-195-5p in the diagnosis of breast cancer

圖4 miR-141和miR-195-5p在診斷乳腺癌的ROC曲線分析Fig 4 ROC curve analysis of miR-141 and miR-195-5p in the diagnosis of breast cancer

miRNAs是一類小分子、非編碼調控的RNAs,由20～24個核苷酸組成,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用,可能是腫瘤早期診斷、治療和評估預后的重要標記物[4-5]。miRNAs在腫瘤中穩(wěn)定表達,并且在血液中具有較高的穩(wěn)定性和特異性,有無創(chuàng)和重復檢測等特點[6],因此血清miRNAs有望成為無創(chuàng)早期診斷腫瘤的新型腫瘤標記物。

本研究顯示乳腺癌患者血清miR-141水平明顯高于健康對照組和乳腺良性病變組,并且發(fā)現手術后乳腺癌患者血清miR-141水平明顯降低。同時發(fā)現,乳腺癌患者血清miR-141表達水平與腫瘤直徑和年齡無關系,而與淋巴結轉移、ER、PR、HER-2、TNM分期、分子分型和組織分型具有明顯相關性;通過多元回歸分析發(fā)現,miR-141表達水平與淋巴結轉移、PR、TNM分期和分子分型呈線性相關性,說明血清miR-141水平能夠反映乳腺的惡性程度,與乳腺癌的預后有一定的相關性。miR-141在不同腫瘤中表達水平不同,且表達方式也有差異,與正常組織相比,胃癌組織中miR-141表達水平明顯降低,并且與腫瘤分期呈負相關[7];在肝癌細胞中表達明顯下降,可抑制肝癌細胞的侵襲和轉移[8];而在結腸癌患者中血清miR-141呈高表達[9],并且認為血清中miR-141高表達說明結腸癌預后不良。在一項乳腺癌組織和乳腺正常標本中進行的miRNA表達譜分析發(fā)現,包括miR-141基因在內共有7個基因表達上調和2個基因表達下調,聯(lián)合上述基因檢測能夠提高乳腺癌診斷的準確性[10]。本研究發(fā)現將miR-141質粒轉染到乳腺癌后,促進腫瘤細胞的增殖和遷移,與文獻報道的結果一致[11],說明miR-141對乳腺癌細胞生長和轉移具有重要臨床意義,推測miR-141可能是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和預后的重要指標。本研究還發(fā)現對于乳腺良性腫瘤鑒別乳腺癌,當血清miR-141>6.664 fmol/L時,靈敏度為80.2%,特異性為88.0%,AUC為0.904,對乳腺癌的診斷具有較高的特異性和靈敏度,可能成為效能較高的診斷指標。

本研究發(fā)現乳腺癌患者血清miR-195-5p表達水平明顯低于乳腺良性病變組和健康對照組,且乳腺癌患者術后血清miR-195-5p水平較治療前明顯升高,說明miR-195-5p是乳腺癌的保護因子。用miR-195-5p質粒轉染乳腺癌細胞后,發(fā)現miR-195-5p具有促進乳腺癌細胞增殖和遷移的作用,說明miR-195-5p是反映乳腺癌生物學特性的指標。這一研究結果與文獻報道相一致:腫瘤細胞miR-195-5p呈低表達,上調miR-195-5p表達能夠明顯抑制細胞增殖[12-13]。本研究還發(fā)現乳腺癌患者血清miR-195-5p表達水平與年齡和腫瘤直徑無相關性,而與淋巴轉移、腫瘤分期及腫瘤分級呈負相關,與ER、PR和HER-2表達陽性呈正相關,通過多元回歸分析發(fā)現miR-195-5p表達水平與淋巴結轉移、PR、TNM分期和分子分型呈線性相關,說明miR-195-5p基因可能與抑癌基因類似。研究顯示miR-195-5p在多種腫瘤中呈低表達:miR-195-5p能夠抑制口腔鱗狀細胞癌的侵襲和轉移,抑制腫瘤的生長[14-15];miR-195-5p能夠通過抑制血管內皮細胞因子的表達,降低腫瘤細胞的侵襲和遷移[16]。

本研究發(fā)現在診斷乳腺良性疾病和乳腺癌方面,患者血清miR-195-5p水平臨界值為3.525 fmol/L,當小于該臨界值診斷乳腺癌的靈敏度為96.8%,特異性為84.0%,AUC為0.912,說明miR-195-5p診斷乳腺癌具有較高的特異性和靈敏度。

本研究發(fā)現血清miR-141和miR-195-5p聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的靈敏度為88.1%,特異性為92.0%,AUC為0.964,聯(lián)合檢測的AUC明顯優(yōu)于miR-141和miR-195-5p單獨檢測,而血清miR-141和miR-195-5p的AUC差異無統(tǒng)計學意義,說明血清miR-141水平與miR-195-5p水平之間存在某種平衡關系,miR-141相當于促癌基因,而miR-195-5p相當于抑癌基因。miR-141和miR-195-5p的來源仍不確定,目前認為主要來自凋亡或壞死細胞,細胞破壞后釋放入血,是反映乳腺癌細胞增殖和遷移的指標,也是乳腺癌預后的指標,同時可能是診斷乳腺癌的早期標記物。

綜上所述,miR-141和 miR-195-5p與乳腺癌細胞增殖和遷移具有密切聯(lián)系,對診斷乳腺癌具有重要的臨床意義。本研究未與經典的鉬靶、超聲和MRI等影像學方法在診斷乳腺癌的效能方面進行比較,需要在將來的研究中予以進一步闡明。