簡(jiǎn) 靜 林 佳 劉秀云 張穎藍(lán) 李 斐 王 鳳 李婷婷 郭 寧 李 強(qiáng)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒科研究所-復(fù)旦大學(xué)兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心-上海市出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201102; 2上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心 上海 201203)

斑馬魚是科學(xué)研究廣泛使用的一種重要脊椎動(dòng)物模型[1],目前已被廣泛用于遺傳、毒理[2-3]和發(fā)育生物[4]等學(xué)科的研究。Rihel等[5]證明斑馬魚可以作為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)藥物研究的一個(gè)快速、可靠且成本較低的工具, 在神經(jīng)疾病的病因?qū)W方面與嚙齒動(dòng)物和人類有許多共同性[6]。4～5天的斑馬魚幼魚即可表現(xiàn)出狩獵,回避和趨觸等廣泛的行為學(xué)[7-9]變化,在人類認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制和新藥的研發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。斑馬魚的凍結(jié)、旋轉(zhuǎn)[12]、漫淡、聚集[13]、沉底、回避和趨觸[14]等行為都可以反映斑馬魚幼魚的神經(jīng)性行為,且趨觸性已經(jīng)被作為衡量斑馬魚幼魚壓力/焦慮水平的最重要指標(biāo),可直接在多孔板中進(jìn)行。

趨觸性行為是指動(dòng)物在所處區(qū)域邊界附近停留或移動(dòng)的偏好。將多孔板中心占整個(gè)孔面積50%的圓形區(qū)域定義為斑馬魚的中心活動(dòng)區(qū)域。用兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的參數(shù)來(lái)研究斑馬魚幼魚的趨觸性行為：第一個(gè)為斑馬魚幼魚在中心區(qū)域移動(dòng)距離的百分比(后文公式1),第二個(gè)為斑馬魚幼魚在中心區(qū)域花費(fèi)時(shí)間的百分比(后文公式2)。

毛果蕓香堿是常用的膽堿能激動(dòng)劑,研究人員常通過(guò)毛果蕓香堿誘導(dǎo)大鼠的慢性癲癇持續(xù)狀態(tài)對(duì)慢性癲癇生理學(xué)和治療手段進(jìn)行探索[15]。 有研究者用毛果蕓香堿誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型具有顯著的焦慮樣狀態(tài)[16-17],但對(duì)用抗癲癇藥物進(jìn)行干預(yù)時(shí)卻只發(fā)現(xiàn)其抑郁狀態(tài)顯著降低而焦慮未被抑制[17-18],Liu和 Duarte等[19-20]的研究結(jié)果表明毛果蕓香堿對(duì)大鼠具有致焦慮的特性。以上結(jié)果表明毛果蕓香堿具有誘發(fā)嚙齒類動(dòng)物產(chǎn)生焦慮的作用,但很少有研究者在斑馬魚上進(jìn)行毛果蕓香堿的研究。探索毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)和焦慮相關(guān)因素的影響可以為斑馬魚焦慮模型的建造和焦慮癥狀的治療提供新思路新方向。

光照-黑暗交替的視覺(jué)反應(yīng)測(cè)試可以引起斑馬魚幼魚的超運(yùn)動(dòng)行為,在光照-黑暗轉(zhuǎn)變期間斑馬魚幼魚趨觸性行為增加[21]。 因此,我們研究了毛果蕓香堿在連續(xù)光照和光照-黑暗交替條件下對(duì)5天齡(5dpf)和7天齡(7dpf) AB型斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)和趨觸性行為的影響,并發(fā)現(xiàn)毛果蕓香堿誘導(dǎo)AB型斑馬魚幼魚產(chǎn)生的焦慮反應(yīng)呈現(xiàn)出藥物濃度和斑馬魚幼魚年齡的依賴性。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生AB型斑馬魚,復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒研所斑馬魚平臺(tái)。 根據(jù)Westerfield《斑馬魚胚胎發(fā)育指南》[22],將斑馬魚飼養(yǎng)在(28.5±0.5) ℃的條件下。斑馬魚自然交配后收集胚胎至直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,每培養(yǎng)皿養(yǎng)殖50顆左右魚卵。從出生到7dpf的魚卵培養(yǎng)皿均放置在(28.5±0.5) ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),期間不予喂食。每天給予14 h光照和10 h黑暗周期(08∶00時(shí)開燈,22∶00關(guān)燈)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試程序均符合國(guó)際規(guī)定,所有協(xié)議由復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院動(dòng)物管理委員會(huì)授權(quán)。

藥物將毛果蕓香堿(P6503-5G,Sigma-Aldrich)用無(wú)菌水溶解到10 mmol/L儲(chǔ)備溶液中,并以1 mL每管冷凍于-20 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)之前,將毛果蕓香堿儲(chǔ)備液用斑馬魚系統(tǒng)水稀釋到所需濃度。

儀器和耗材斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)-北京愛(ài)生公司,Leica205C顯微鏡-德國(guó)Leica公司,ZebraLab分析系統(tǒng)-法國(guó)Viewpoint公司;細(xì)胞培養(yǎng)24孔TCT板-上海吉泰遠(yuǎn)成公司。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)所有行為測(cè)試都在環(huán)境溫度為28.5 ℃的房間內(nèi)進(jìn)行,斑馬魚幼魚魚卵隨機(jī)分配在24孔板中進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。所有實(shí)驗(yàn)均在培養(yǎng)箱中光照后2 h和黑暗前2 h之間進(jìn)行。每個(gè)24孔板中魚卵均勻的呈現(xiàn)所有濃度,以避免實(shí)驗(yàn)次序?qū)е碌娜魏尾町悺?/p>

行為學(xué)檢測(cè)開放曠場(chǎng)和光照設(shè)計(jì)如圖1所示:在實(shí)驗(yàn)前將斑馬魚幼魚轉(zhuǎn)移至24孔板中,每孔中一條幼魚,孔的內(nèi)徑為15.88 mm,幼魚可自由活動(dòng)(圖1A)。去除孔中多余的液體后立即加入1 mL的毛果蕓香堿工作溶液,毛果蕓香堿最終的測(cè)試濃度為0、0.1、0.3、1、3、10 mmol/L。然后將24孔板放入帶有記錄儀(ViewPoint Life Sciences)的ZebraBox中記錄斑馬魚幼魚的活動(dòng)視頻。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為20 min光照適應(yīng),10 min持續(xù)光照研究斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)和趨觸性,然后分別是5 min黑暗刺激和5min光照恢復(fù)(圖1B),以檢測(cè)在光照變化時(shí)毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)和趨觸性的影響。因此,包括適應(yīng)期在內(nèi),每次實(shí)驗(yàn)持續(xù)40 min。圖2顯示的是不同濃度的毛果蕓香堿在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)斑馬魚幼魚每分鐘自發(fā)游動(dòng)距離的影響。

A:The testing apparatuses consist of each well in a 24-well plate format (diameter of 15.88 mm).The inner and outer zones were delineated as shown above.The width of the outer zone was set at 2.34 mm relative to the border of the well;B:The procedure including acclimatization and experiment procedure,acclimatization 20 mins,and experiment procedure light phase (0-10 min),sudden illumination transition from light to dark phase (10-15 min) and dark to light phase (15-20 min).
圖1 開放曠場(chǎng)和光照設(shè)計(jì)示意圖
Fig 1 The open field test and light testing apparatuses

參數(shù)計(jì)算使用ZebraLab軟件的跟蹤模式來(lái)記錄視頻,完成斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的定量。斑馬魚幼魚的視頻以25 fps的速率拍攝,可檢測(cè)幼魚任意速度級(jí)別的運(yùn)動(dòng)。在每個(gè)孔中,確定了一個(gè)占據(jù)單井面積一半的圓形中心區(qū)域。幼魚在整個(gè)孔中移動(dòng)的距離可以用來(lái)分析斑馬魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)。對(duì)趨向性行為的分析來(lái)自于[23]對(duì)移動(dòng)距離和幼魚在中心舞臺(tái)上花費(fèi)的時(shí)間的修改。 公式如下所示

(公式1)

(公式2)

結(jié) 果

連續(xù)光照條件下毛果蕓香堿對(duì)不同年齡階段斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響毛果蕓香堿對(duì)5dpf斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響以藥物濃度0.3 mmol/L分為兩個(gè)階段。0.1 mmol/L的毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)有明顯的抑制作用(P=0.021 3);而當(dāng)藥物濃度大于0.3 mmol/L后,隨著藥物濃度的增加反倒對(duì)斑馬魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)有一定的刺激作用但均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。

毛果蕓香堿對(duì)7dpf斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響不同于對(duì)5dpf斑馬魚,只有10 mmol/L毛果蕓香堿使斑馬魚幼魚的游動(dòng)距離減弱,其他各組均表現(xiàn)出一定的刺激作用,但所有濃度組均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。

The distance moved in each 1-min time bin during 20-min measurements period (0-min to 20-min) was plotted against the progression of the experiment.The control group (open circles) was plotted with a single pilocarpine concentration group (filled circles) in each panel.The shaded part in each panel represents the 5-min dark phase,and the non-shaded part in each panel represents the light phase.
圖2 不同濃度的毛果蕓香堿在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)斑馬魚幼魚每分鐘自發(fā)游動(dòng)距離的影響
Fig 2 Distance moved by zebrafish larvae within the entire zone during all experiment measurements periodunder different concentrations of pilocarpine

A:5dpf;B:7dpf.(1)vs.Control,P<0.05.
圖3 連續(xù)光照條件下不同濃度毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響
Fig 3 Effects of pilocarpine exposure on the locomotor activity of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under continuous light condition

連續(xù)光照條件下毛果蕓香堿對(duì)不同年齡階段斑馬魚趨觸性行為的影響在沒(méi)有使用毛果蕓香堿處理的對(duì)照組5dpf和7dpf的斑馬魚幼魚都表現(xiàn)出一定的趨觸性行為,而使用較高濃度的毛果蕓香堿后5dpf和7dpf的斑馬魚幼魚趨觸性行為都有所增加。 5dpf的斑馬魚幼魚的趨觸性行為并未因?yàn)槊|香堿濃度的改變而產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在濃度大于1 mmol/L后其中心區(qū)域游動(dòng)距離(圖4A)和時(shí)間(圖4C)均隨藥物濃度增高而降低,呈現(xiàn)出藥物依賴性的趨觸性增加。相比之下,當(dāng)藥物濃度大于0.1 mmol/L后7dpf斑馬魚趨觸性行為的改變呈現(xiàn)出一定的藥物濃度依賴性,尤其3 mmol/L和10 mmol/L的毛果蕓香堿使7dpf斑馬魚趨觸性行為明顯增加,即中心區(qū)域游動(dòng)距離減少(P=0.005 5,P=0.000 8)(圖4B)以及中心區(qū)域游動(dòng)時(shí)間減少(P=0.001 4,P=0.001 8)(圖4D)。

A,C:5dpf;B:7dpf.vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01.
圖4 連續(xù)光照條件下不同濃度毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚趨觸性的影響
Fig 4 Effects of pilocarpine exposure on the thigmotaxis of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under continuous light condition

光暗交替階段毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)和趨觸性行為的影響

毛果蕓香堿對(duì)5dpf斑馬魚光照變化刺激的影響 雙因素方差分析顯示:F光照(1,372)=80.87,P光照<0.000 1;F毛果蕓香堿 (5,372)=3.297,P毛果蕓香堿=0.006 3。光照變化前的1 min內(nèi),0.1、0.3 mmol/L毛果蕓香堿降低了斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng),而1、3、10 mmol/L均增加了斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng),但未產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。黑暗階段,10 mmol/L毛果蕓香堿顯著抑制了斑馬魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)(P<0.000 1)。在相同濃度的毛果蕓香堿時(shí),對(duì)照0.1、0.3、1 mmol/L毛果蕓香堿處理的斑馬魚幼魚在黑暗環(huán)境中較光照條件下自發(fā)運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)(P<0.000 1,P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.024 2),而10 mmol/L時(shí)黑暗環(huán)境下毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的抑制已經(jīng)完全抵消掉了黑暗本身對(duì)斑馬魚視覺(jué)刺激下的自發(fā)運(yùn)動(dòng)升高現(xiàn)象(圖5A)。

毛果蕓香堿對(duì)7dpf斑馬魚光照變化刺激的影響 雙因素方差分析顯示:F光照(1,372)=2.6,P光照=0.107 7;F毛果蕓香堿(5,372)= 6.431,P毛果蕓香堿<0.000 1,與毛果蕓香堿對(duì)5dpf斑馬魚光照變化刺激的影響明顯不同,7dpf的斑馬魚幼魚只在黑暗刺激下且用10 mmol/L的毛果蕓香堿處理時(shí)其自發(fā)運(yùn)動(dòng)才與對(duì)照組有明顯的差異(P=0.000 3),而其他各濃度處理后光暗變化未對(duì)斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)的改變。3、10 mmol/L的毛果蕓香堿在黑暗環(huán)境下對(duì)斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的抑制已經(jīng)完全抵消掉了黑暗本身對(duì)斑馬魚視覺(jué)刺激下的自發(fā)運(yùn)動(dòng)升高現(xiàn)象(圖5B)。

A:5dpf;B:7dpf.There were signicant differences between the light and dark conditions within the same pilocarpine concentration group,(1)P<0.05,(2)P<0.000 1.Versus the control group under the same lighting conditions (light or dark),(3)P<0.000 1,(4)P<0.001.
圖5 光暗交替條件下不同濃度毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響
Fig 5 Effects of pilocarpine exposure on the locomotor activity of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under light and dark condition

毛果蕓香堿對(duì)5dpf斑馬魚幼魚趨觸性行為的影響雙因素方差分析斑馬魚幼魚中心區(qū)域游動(dòng)距離F光照(1,336)=3.398,P光照=0.005 2;F毛果蕓香堿(5,336)=91.7,P毛果蕓香堿<0.000 1。各濃度組在光照變化前的1 min內(nèi)對(duì)斑馬魚幼魚趨觸性行為的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在黑暗刺激下3mmol/L的毛果蕓香堿顯著的增加了5dpf斑馬魚的趨觸性行為(P=0.000 1)。但光暗變化期間,所有濃度的毛果蕓香堿處理都使得5dpf的斑馬魚幼魚在黑暗環(huán)境下較光照環(huán)境下的趨觸性行為降低(P=0.000 7,P=0.013 9,P=0.038 7,P<0.000 1,P=0.000 3,P<0.000 1)(圖6A)。

雙因素方差分析斑馬魚幼魚中心區(qū)域游動(dòng)時(shí)間F光照(1,341)=88.18,P光照<0.000 1;F毛果蕓香堿(5,341)=5.55,P毛果蕓香堿<0.000 1,光照條件下,3 mmol/L和10 mmol/L的毛果蕓香堿明顯的增加了斑馬魚幼魚的趨觸性行為(P=0.003 4,P=0.034 0)。但各濃度毛果蕓香堿處理后5dpf的斑馬魚幼魚在光暗交替階段黑暗環(huán)境下的趨觸性行為降低,除0.1 mmol/L之外,對(duì)照0.3、1、3、10 mmol/L的毛果蕓香堿使黑暗環(huán)境下5dpf斑馬魚趨觸性行為降低較其在光照條件下有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002 1,P=0.014 0,P=0.000 7,P<0.000 1,P<0.000 1)(圖6C)。

毛果蕓香堿對(duì)7dpf斑馬魚幼魚趨觸性行為的影響用雙因素方差分析斑馬魚幼魚在中心區(qū)域的游動(dòng)距離:F光照(1,361)=6.783,P光照<0.000 1;F毛果蕓香堿(5,361)=58.42,P毛果蕓香堿<0.000 1。光照條件下,斑馬魚幼魚的趨觸性行為隨毛果蕓香堿濃度增加而逐漸增加,當(dāng)毛果蕓香堿濃度達(dá)到3 mmol/L和10 mmol/L時(shí)明顯的增加了斑馬魚幼魚的趨觸性行為(P=0.032 2,P=0.008 6);在黑暗刺激下,毛果蕓香堿濃度>1 mmol/L時(shí)隨毛果蕓香堿濃度增加而逐漸增加,10 mmol/L的毛果蕓香堿明顯的增加了7dpf斑馬魚的趨觸性行為(P=0.000 1)。所有濃度的毛果蕓香堿處理都使得7dpf的斑馬魚幼魚在黑暗環(huán)境下趨觸性行為較光照條件下降低,且0.1、0.3、1、3 mmol/L的毛果蕓香堿在黑暗環(huán)境下對(duì)斑馬魚趨觸性行為的抑制作用較光照條件下差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,P=0.000 7,P=0.010 3,P=0.005 4,圖6B)。

雙因素方差分析斑馬魚幼魚中心區(qū)域游動(dòng)時(shí)間:F光照(1,364)=5.313,P光照<0.000 1;F毛果蕓香堿(5,364)=57.21,P毛果蕓香堿<0.000 1。 光照條件下,3 mmol/L和10 mmol/L的毛果蕓香堿明顯的增加了斑馬魚幼魚的趨觸性行為(P=0.038 2,P=0.034 9);在黑暗刺激下10 mmol/L的毛果蕓香堿增加了7dpf斑馬魚的趨觸性行為(P=0.001 1)。所有濃度的毛果蕓香堿處理都使得7dpf的斑馬魚幼魚在黑暗環(huán)境下趨觸性行為較光照降低,且對(duì)照0.1、0.3、1、3 mmol/L的毛果蕓香堿在黑暗環(huán)境下對(duì)斑馬魚趨觸性行為的抑制作用較光照條件下差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033 2,P=0.000 3,P=0.003 2,P=0.023 1,P=0.006 8,圖6D)。

A,C:5dpf;B,D:7dpf.There were signicant differences between the light and dark conditions within the same pilocarpine concentration group,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001,(4)P<0.000 1.Versus the control group under the same lighting conditions (light or dark),(5)P<0.05,(6)P<0.01,(7)P<0.001.
圖6 光暗交替條件下不同濃度毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚趨觸性的影響
Fig 6 Effects of pilocarpine exposure on the thigmotaxis of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under light and dark condition

討 論

毛果蕓香堿對(duì)不同年齡斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響不同本研究分別考察了毛果蕓香堿處理對(duì)連續(xù)光照和光暗交替條件下斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響,5dpf和7dpf的斑馬魚在毛果蕓香堿處理后沒(méi)有表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。在5dpf,斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)隨著毛果蕓香堿濃度的增加先降低再升高,而7dpf斑馬魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)則呈持續(xù)性的增加,直到毛果蕓香堿濃度達(dá)最高濃度10 mmol/L時(shí)斑馬魚幼魚的活動(dòng)受到抑制。5dpf的斑馬魚幼魚與對(duì)照組相比,0.1 mmol/L時(shí)其自發(fā)運(yùn)動(dòng)受到最大的抑制,但在10 mmol/L藥物濃度時(shí)毛果蕓香堿并未對(duì)斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)造成明顯的改變,這可能與毛果蕓香堿毒蕈堿樣中毒癥狀造成的肌肉痙攣收縮相關(guān)。我們的研究中毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響與以往在環(huán)鴿研究中的結(jié)果相似[8]。在對(duì)環(huán)鴿的研究中,急性施用毒蕈堿激動(dòng)劑毛果蕓香堿 (1和3 mg/kg i.p.) 后,處理組在第1 h和第2 h期間引起了環(huán)鴿自發(fā)運(yùn)動(dòng)劑量依賴性的降低。但是與Shannon等[25]在小鼠上的研究結(jié)果不一致,他們發(fā)現(xiàn)用毛果蕓香堿干預(yù)不會(huì)造成小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的改變,這可能是因?yàn)樵诓煌难芯恐?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種、年齡以及實(shí)驗(yàn)干預(yù)的方式尤其時(shí)間等都不完全相同。普遍認(rèn)為膽堿能神經(jīng)元參與攻擊,運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知等高級(jí)功能的調(diào)節(jié)[26];本研究中持續(xù)光照條件下較高濃度組毛果蕓香堿處理的斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)可能與毛果蕓香堿的膽堿能激活作用相關(guān)。

毛果蕓香堿可在一定程度上增加斑馬魚幼魚的焦慮水平Richendrfer等[21]將5-7dpf斑馬魚放入多孔板后,幼魚表現(xiàn)出對(duì)孔邊緣區(qū)域的強(qiáng)烈偏好,且這種偏好可以通過(guò)環(huán)境刺激進(jìn)一步增強(qiáng),反映出這種外來(lái)的環(huán)境刺激增加了斑馬魚幼魚的焦慮水平。

綜合中心區(qū)域的距離和時(shí)間兩種指標(biāo)發(fā)現(xiàn),除了0.1 mmol/L組外,所有濃度毛果蕓香堿處理均導(dǎo)致斑馬魚幼魚趨觸性隨濃度和年齡的增加而增加,反映出焦慮水平的增加。相似地Liu等[19]在試驗(yàn)中用低于驚厥劑量的毛果蕓香堿對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,結(jié)果表明次于驚厥劑量的毛果蕓香堿對(duì)大鼠具有致焦慮特性。我們研究中觀察到毛果蕓香堿的致焦慮作用與其他學(xué)者在嚙齒動(dòng)物模型中的結(jié)果一致,且近期已有研究進(jìn)一步對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)焦慮的機(jī)制進(jìn)行了探索。普遍認(rèn)為毛果蕓香堿導(dǎo)致的焦慮可在癲癇的診斷之前或癲癇后期合并癥中存在,主要與大腦皮質(zhì)、海馬及眾多神經(jīng)節(jié)和傳導(dǎo)通路內(nèi)γ-氨基丁酸能神經(jīng)元受到抑制相關(guān),GABA的缺乏或抑制會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的焦慮、不安;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明這種焦慮的產(chǎn)生可以被外源性膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子挽救[27]。

我們首次研究了毛果蕓香堿處理對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響,并觀察到了毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚的致焦慮特征,且7dpf的斑馬魚幼魚趨觸性行為的兩個(gè)衡量參數(shù)較5dpf斑馬魚更一致,這可能與7dpf斑馬魚的游動(dòng)能力以及自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為更為完善相關(guān)。

低濃度毛果蕓香堿可引起斑馬魚幼魚的光暗應(yīng)激反應(yīng),而毛果蕓香堿降低了暗刺激對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的刺激作用4dpf時(shí),野生型斑馬魚幼魚便可以對(duì)光暗條件的改變做出反應(yīng),在光線變暗時(shí)表現(xiàn)出自發(fā)運(yùn)動(dòng)的增加[28-29]。在本研究中,低濃度毛果蕓香堿處理組斑馬魚幼魚在整個(gè)研究過(guò)程中對(duì)光暗變化刺激始終有反應(yīng);但當(dāng)毛果蕓香堿達(dá)到10 mmol/L時(shí),黑暗刺激下斑馬魚幼魚超運(yùn)動(dòng)已經(jīng)被完全廢除。在5dp和7dpf對(duì)照組以及0.1、0.3、1 mmol/L毛果蕓香堿處理的5dpf斑馬魚組,黑暗刺激產(chǎn)生的超級(jí)運(yùn)動(dòng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而7dpf斑馬魚在任何濃度的毛果蕓香堿處理下其超運(yùn)動(dòng)的產(chǎn)生均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也就是意味著,較高濃度的毛果云香堿及較完整的斑馬魚神經(jīng)發(fā)育可以削弱光暗轉(zhuǎn)變后暗刺激所激發(fā)的斑馬魚超運(yùn)動(dòng)行為,具體機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚趨觸性行為的影響統(tǒng)一與差異共存與光照階段相比,我們觀察到所有濃度毛果蕓香堿處理的5dpf斑馬魚(包括對(duì)照組)在黑暗中焦慮水平的降低,但以中心區(qū)域游動(dòng)時(shí)間百分比這一指標(biāo)來(lái)衡量時(shí)發(fā)現(xiàn)黑暗刺激下5dpf斑馬魚同時(shí)存在焦慮隨毛果蕓香堿濃度變化而變化的現(xiàn)象,高濃度時(shí)相對(duì)增加了斑馬魚幼魚的焦慮水平。但無(wú)論以中心區(qū)域游動(dòng)距離百分比還是中心區(qū)域游動(dòng)時(shí)間百分比來(lái)衡量,7dpf斑馬魚的焦慮水平呈藥物劑量依賴性提高。5dpf和7dpf的斑馬魚之間明顯的差異可能反映了斑馬魚幼魚早期發(fā)育階段神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的差異。

在以往的研究中,5dpf的AB型斑馬魚幼魚在光暗交替試驗(yàn)的黑暗階段表現(xiàn)出趨觸性行為的增加,而在黑暗階段給予微弱的照明時(shí),可以減少趨觸性行為,表明黑暗環(huán)境比光照環(huán)境更易對(duì)斑馬魚幼魚形成壓力[8]。在課題組的多項(xiàng)研究中,斑馬魚對(duì)突然暗刺激的反應(yīng)與Schn?rr 等的發(fā)現(xiàn)不一致[30-31]。我們的研究中,對(duì)照組的斑馬魚在光線突然發(fā)生轉(zhuǎn)變后更趨向于在測(cè)驗(yàn)孔板的中心區(qū)域進(jìn)行游動(dòng)和探索,體現(xiàn)出在我們的暗刺激下斑馬魚壓力降低且對(duì)新環(huán)境更為新奇,趨觸性下降,焦慮水平降低。這種結(jié)果之間的差異可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)置中斑馬魚幼魚的遺傳背景、對(duì)黑暗適應(yīng)程度以及溫度和測(cè)試時(shí)間等多種因素不同所導(dǎo)致。

我們研究了不同光照條件下毛果蕓香堿對(duì)5dpf和7dpf斑馬魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)和趨觸性行為的影響并因此發(fā)現(xiàn)：在同樣的光照環(huán)境和毛果蕓香堿藥物濃度時(shí),5dpf和7dpf的斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)并不完全一致,提示毛果蕓香堿對(duì)斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響可能與斑馬魚的年齡相關(guān);且毛果蕓香堿藥物濃度和斑馬魚幼魚年齡是焦慮模型中兩個(gè)關(guān)鍵因素,在我們的研究中,10 mmol/L的毛果蕓香堿對(duì)7dpf的斑馬魚幼魚有明顯的致焦慮作用。我們成功地建立了毛果蕓香堿誘導(dǎo)的斑馬魚焦慮模型,進(jìn)一步為以斑馬魚為模式動(dòng)物研究焦慮癥的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供了更為便捷的方法。

目前,可方便地利用視頻跟蹤對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行精確的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)及進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析,有助于在實(shí)驗(yàn)中降低成本的同時(shí)提高效率,已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)及行為學(xué)的研究評(píng)價(jià)中,視頻跟蹤系統(tǒng)的強(qiáng)大功能與斑馬魚模型相結(jié)合為模擬疾病的發(fā)生及探索疾病發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了重要的方向。