袁 夢，沈宗澤，封 磊，宋 萍，韓曉剛，游 凱，蘇 丹，李 航

(1.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州350002)

鋅（Zn）是生命體的一種必要微量元素，也是一種重金屬.它雖然毒性小，但不易降解，可通過食物鏈在生物體內(nèi)大量富集，這不僅會對環(huán)境造成一定的危害，還會威脅人類的健康和生存[1].我國是產(chǎn)鋅大國，產(chǎn)量位居世界首位，隨著鋅產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，鋅污染問題越來越嚴(yán)重.因此，解決鋅的環(huán)境污染問題變得尤為重要.

微生物修復(fù)技術(shù)是利用一些具有重金屬抗性或吸附性能的微生物的吸附、轉(zhuǎn)化和沉淀作用，降低重金屬的毒性，達到改善環(huán)境的目的[2].其中，微生物吸附法具有無二次污染、成本低、操作簡單等優(yōu)點，應(yīng)用前景十分廣闊.研究已證明一些微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌均可表現(xiàn)出一定的重金屬吸附能力，且微生物菌體活性及胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）對其重金屬吸附能力具有重要影響[3-5].例如：Tangaromsuk et al[6]發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）活菌體對Cd2＋表現(xiàn)出很好的吸附性能；Gabr et al[7]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌（Pseudomona aeruginosa）非活性菌體對Pb2＋表現(xiàn)出更強的吸附能力；Martine et al[8]通過試驗證明，異養(yǎng)菌的EPS對 Pb2＋、Cu2＋和 Cd2＋均表現(xiàn)出較強的吸附能力；Yang et al[9]研究表明，克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）的 EPS對 Cu2＋的吸附能力明顯強于對Zn2＋的吸附能力；王亮等[10]發(fā)現(xiàn)去除菌體EPS后，白腐真菌對Pb2＋的吸附能力明顯減弱.

目前，有關(guān)微生物對重金屬的吸附研究大多集中于Cd2＋、Pb2＋等方面，有關(guān)微生物對Zn2＋吸附機理的研究較少.本研究以實驗室前期篩選的一株具有Zn2＋吸附能力的細(xì)菌S3為對象，測定其Zn2＋吸附特征，并比較菌體活性及EPS對其吸附過程的影響，以期為進一步揭示微生物的重金屬吸附機制和探究環(huán)境鋅污染的微生物治理技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：耐鋅微生物S3由本實驗室保藏，篩選自鋅污染土壤.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1；配制固體LB培養(yǎng)基需要另加入16 g·L-1瓊脂粉.

含重金屬培養(yǎng)基：將配制好的LB液體培養(yǎng)基和重金屬溶液進行高溫滅菌，再向已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中加入一定量的重金屬溶液.

1.2 菌株鑒定

菌落形態(tài)觀察：將菌株純化后，接種到固體LB培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌落的顏色和形態(tài).

16S rDNA基因序列分析：提取基因組，利用PCR擴增目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物純化，切膠回收目的片段交由大連寶生物公司進行DNA測序；然后把得到的堿基序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，運用Blast對其同源性進行比對；再利用軟件MEGA 4.1和ClustalX建立系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株的種類.

1.3 Zn2＋對菌株生長影響的測定

1.3.1 最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC)測定 取 180 μL 含 Zn2＋濃度分別為 100、200、300、400、500、600、700 mg·L-1的 LB 培養(yǎng)基加入到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并向每孔接種 20 μL 菌液（麥?zhǔn)蠞岫?×107cfu·mL-1）.在150 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng)，36 h后測量在600 nm波長下的光密度（D）值.設(shè)置不含Zn2＋的空白組，并以重金屬抑制細(xì)菌生長的最低濃度為MIC[11].

1.3.2 Zn2＋對菌株生長的影響 將菌株S3以1%的接種量分別接種到含Zn2＋濃度為100、200、300和400 mg·L-1的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，且培養(yǎng)基均放在規(guī)格為250 mL的三角瓶內(nèi)，然后在150 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng).每隔6 h取培養(yǎng)液樣品，測量其在600 nm波長下的D值.

1.3.3 菌株吸附Zn2＋前后激光共聚焦觀察 利用Leica TCS-SP2激光共聚焦顯微鏡，在波長為514 nm[12]的條件下觀察菌株S3的形態(tài).

1.4 菌體對Zn2＋的吸附

1.4.1 菌體的收集 先取單菌落S3接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將其作為種子液在150 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng)18 h.再以1%的接種量將其接種到新鮮的盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)到穩(wěn)定期.取出培養(yǎng)液，在4℃、4500g條件下離心30 min，棄掉上清液保留菌體，再加入無菌水洗滌、離心，重復(fù)3次，最后得到濕菌體備用.

1.4.2 菌體的吸附試驗 前期的試驗表明，Zn2＋濃度為100 mg·L-1時，S3菌體的吸附能力較好，所以后續(xù)試驗的Zn2＋濃度均為100 mg·L-1.向含100 mg·L-1Zn2＋的100 mL LB液體培養(yǎng)基（盛于250 mL三角瓶內(nèi)）中加入 0.1 g S3 濕菌體，在150 r·min-1、30 ℃條件下分別培養(yǎng) 10、20、40、60、80、120 min 取樣，然后在同樣條件下離心10 min，取其上清液測量Zn2＋含量，并計算吸附率.每個處理做3組重復(fù).

1.4.3 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM)分析 制備2.5%戊二醛溶液，分別加入吸附Zn2＋前后的菌體，并置于4℃下保存固定.過夜后，先用PBS緩沖液洗滌菌體3次，再依次用乙醇和醋酸異戊酯脫水、置換，最后進行冷凍真空干燥、噴金[13]，用SEM（日立5-520型）觀察菌體表面特征并拍照.

1.4.4 傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transforms infrared analysis，F(xiàn)TIR)分析 分別將吸附Zn2＋前后的菌體進行冷凍真空干燥，然后將其置于研缽中，再加入適量溴化鉀（KBr）完全研磨并混勻后制成薄片，通過Nicolet 6700 FTIR分析紅外光譜.最后，根據(jù)紅外光譜中特征吸收峰的變化，鑒定樣品中的化合物和官能團[14].

1.4.5 菌體活性對吸附率的影響 非活性菌體的制備：將濕菌體在80℃下烘干至恒重，保留下來的菌體即為非活性菌體.

稱取0.1 g非活性菌體加入到含100 mg·L-1Zn2＋的100 mL LB液體培養(yǎng)基（盛于250 mL三角瓶）中.按 1.4.2 的方法測定 Zn2＋含量，并計算吸附率.

1.5 菌體EPS對Zn2＋的吸附

1.5.1 菌體EPS的提取 取出前期培養(yǎng)至穩(wěn)定期的S3菌液，在4℃、4500g條件下離心10 min，棄掉上清液，再加入無菌水定容至5 mL后搖勻.在冰水浴條件下以40 W超聲攪拌破碎3 min，然后在4℃、10000 r·min-1條件下離心10 min，并選用0.22 μm纖維素濾膜過濾上清液，最后得到的液體為EPS樣品.

1.5.2 菌體EPS組成成分的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法[15]；多糖含量的測定采用苯酚—硫酸法[16].

1.5.3 菌體EPS的吸附試驗 先取50 mL含50 mg·L-1Zn2＋的溶液加入到燒杯中，再向預(yù)處理過的透析袋中加入20 mL濃度為100 mg·L-1的菌體EPS溶液，最后將透析袋夾好后放到燒杯內(nèi).按1.4.2的方法測定Zn2＋含量，并計算吸附率.

1.6 吸附動力學(xué)分析

吸附動力學(xué)的研究范疇主要包括吸附速率和吸附機理，最常用的動力學(xué)模型為準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型.其中，準(zhǔn)一級動力學(xué)模型是由Lagergren方程[17]推導(dǎo)而來，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型由McKay方程[18]推導(dǎo)而來.采用動力學(xué)模型擬合試驗數(shù)據(jù)，進而對菌體及菌體EPS的吸附行為進行分析.

對上式兩邊進行積分，轉(zhuǎn)換成直線方程：ln(qe-qt)＝lnqe-k1t.

式中，qt和qe分別表示t時的吸附量和達到吸附平衡時的吸附量，k1是一級動力學(xué)方程常數(shù).以ln(qe-qt)對時間t作圖，可以計算出準(zhǔn)一級動力學(xué)模型相關(guān)參數(shù)k1和qe.

式中，qt和qe分別表示t時的吸附量和達到吸附平衡時的吸附量，k2是準(zhǔn)二級動力學(xué)方程常數(shù).以對時間t作圖，可以計算出準(zhǔn)二級動力學(xué)模型相關(guān)參數(shù)k2和qe.

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鋅細(xì)菌的鑒定

由圖1A可以看出，S3菌落為不透明的乳白色濕潤菌體，呈圓凸?fàn)?，邊緣整齊，且易于挑起.將S3菌體置于光學(xué)顯微鏡下，可以看出S3呈桿狀，且無鞭毛（圖1B）.

在GenBank上注冊菌株S3的16S rDNA基因序列，其登錄號為KX664480.利用Blast程序比較其序列相似性，得出菌株S3與Sphingobacterium caeni（登錄號為NR-109661.1）相似性高達99%，表明二者基因序列的同源性為99%.由圖2也可以看出，S3與S.caeni位于同一個分支，因此確定菌株S3屬于鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）.

圖1 S3菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain S3

2.2 Zn2＋對菌株生長的影響

2.2.1 Zn2＋對菌株 S3 生長的 MIC 由圖3可知，Zn2＋會對S3的生長產(chǎn)生一定影響，其光密度隨著Zn2＋濃度的增大而減小.當(dāng)Zn2＋濃度達到500 mg·L-1后，光密度的減小幅度逐漸趨于平緩，表明500 mg·L-1為Zn2＋對 S3 的 MIC.根據(jù) Mergeay et al[19]的分類，Zn2＋對菌株的MIC值在65～650 mg·L-1之間為中度耐鋅細(xì)菌，而MIC值超過650 mg·L-1則為抗鋅細(xì)菌.因此，可以判定菌株S3為中度耐鋅細(xì)菌，對Zn2＋表現(xiàn)出較強的耐受性.

圖3 Zn2＋對S3的最小抑制濃度Fig.3 Minimum inhibitory concentration of Zn2＋ to S3

2.2.2 Zn2＋濃度對菌株生長的影響 由圖4 可知，在含不同濃度Zn2＋的LB培養(yǎng)基中，S3菌體的生長受到不同程度的抑制，并且其生長能力隨Zn2＋濃度的增大而逐漸減弱.高濃度的Zn2＋能顯著抑制菌體的生長，但生長并未停止，表明S3菌體對Zn2＋具有較強耐受性.

2.2.3 S3吸附Zn2＋前后激光共聚焦觀察 由圖5可以看出，未吸附Zn2＋的S3菌體呈聚集狀，個體形態(tài)模糊，且從中能夠看到少量的菌體呈桿狀.吸附Zn2＋之后，菌體的密度下降，但大部分仍然聚集.這表明Zn2＋對S3菌體產(chǎn)生了一定的毒性.

圖4 Zn2＋濃度對S3生長的影響Fig.4 Effects of Zn2＋ concentrations on the growth of S3

圖5 菌體S3吸附Zn2＋前后激光共聚焦顯微圖Fig.5 Laser scanning confocal micrograph of S3 before and after Zn2＋ adsorption

2.3 菌株的Zn2＋吸附特征

2.3.1 菌株 S3對 Zn2＋的吸附過程 由圖6可知，菌株S3在120 min內(nèi)對Zn2＋的吸附過程主要分為3個階段：前20 min為快速吸附，到20 min時吸附率達到50.4%；在20～60 min吸附率的上升速度減緩；80 min后達到吸附平衡，此時吸附率為54.1%.

圖6 培養(yǎng)不同時間后菌株S3對Zn2＋的吸附率Fig.6 Adsorption rates of Zn2＋ by strain S3 cultured for different durations

2.3.2 菌體吸附Zn2＋前后SEM分析 從圖7可以看出，S3菌體呈桿狀，這與鞘氨醇桿菌形態(tài)特征[20]一致.在吸附Zn2＋之前，S3菌體的細(xì)胞個體形態(tài)較為飽滿；而在吸附Zn2＋之后，部分細(xì)胞呈現(xiàn)干癟狀，并且表面有晶體沉淀.這可能是由于菌體細(xì)胞在吸附Zn2＋的過程中分泌代謝物，并與Zn2＋形成沉淀物，這也增強了菌體自身對重金屬離子的耐受性[21].

2.3.3 菌體吸附Zn2＋前后FTIR分析 由圖8可以看出，S3菌體在吸附Zn2＋前后的光譜圖變化不大.在波數(shù)為3292 cm-1處，締合O-H或N-H吸收峰位移至3298 cm-1處，吸收峰強度減弱；在2923 cm-1處，-CH伸縮振動峰強度略微減弱，但沒有發(fā)生位移；在2361 cm-1處，吸收峰強度減弱，可能與P-H振動有關(guān)；在1653 cm-1處，酰胺Ⅰ帶吸收峰強度（C＝O的伸縮振動）減弱，但并未出現(xiàn)顯著的位移；在1057 cm-1處，C-O伸縮振動峰強度略微減弱，且位移至1070 cm-1處.因此，參與S3菌體Zn2＋吸附過程的官能團主要有締合O-H、N-H和多糖的C-O.

圖7 菌體S3吸附Zn2＋前后的SEM圖Fig.7 Scanning electron micrograph of S3 before and after Zn2＋ adsorption

圖8 菌體S3吸附Zn2＋前后的FTIR圖Fig.8 FTIR spectrogram of S3 before and after Zn2＋adsorption

2.3.4 菌體活性對吸附率的影響 由圖9可以看出，在120 min內(nèi)，S3非活性菌體的Zn2＋吸附能力弱于活性菌體.非活性菌體達到吸附平衡的時間在60 min左右，而活性菌體則在80 min左右才實現(xiàn)吸附平衡.其原因可能是活性菌體的前期吸附過程有2個階段，第一階段是發(fā)生在細(xì)胞表面的快速吸附，第二階段是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的緩慢吸附；而非活性菌體前期僅有細(xì)胞表面吸附階段.

圖9 培養(yǎng)不同時間后菌株S3的活性菌體和非活性菌體對Zn2＋的吸附率Fig.9 Adsorption rates of Zn2＋ by active and inactive bacteria of strain S3 cultured for different durations

2.4 菌體EPS的Zn2＋吸附特征

2.4.1 EPS的組成 S3菌體EPS中蛋白質(zhì)含量（58.140 mg·L-1）明顯低于多糖含量（88.730 mg·L-1）.該結(jié)果與李久義等[22]得到的結(jié)論一致.

2.4.2 EPS對Zn2＋的吸附過程 由圖10可知，菌體EPS在120 min內(nèi)對Zn2＋的吸附過程主要分為3個階段，與S3菌株對Zn2＋的吸附過程一致.第一階段為快速吸附，到20 min時吸附率為29.2%；第二階段（20～60 min）吸附率的上升速度減緩；第三階段（80 min后）實現(xiàn)吸附平衡，此時吸附率為32.4%.因此，S3菌體EPS對Zn2＋的吸附主要集中在第一階段.吸附率發(fā)生變化的原因：菌體EPS在前20 min內(nèi)有足夠的Zn2＋吸附位點，吸附率迅速增大；吸附位點在20～60 min逐漸減少，吸附率變化減慢；到80 min后，菌體EPS上的吸附位點飽和，實現(xiàn)吸附平衡[23].

圖10 培養(yǎng)不同時間后菌株S3 EPS對Zn2＋的吸附率Fig.10 Adsorption rates of Zn2＋ by strain S3 EPS cultured for different durations

2.5 吸附動力學(xué)模型

將S3活性菌體和非活性菌體的Zn2＋吸附過程擬合準(zhǔn)一級動力學(xué)方程，其線性相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.952和0.872，平衡吸附量分別為12.950和3.210 mg·g-1，與實際數(shù)據(jù)有很大差異；但將其擬合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，R2分別為0.997和0.999，且算出的平衡吸附量與實際數(shù)據(jù)差距較小（表1）.菌體EPS也具有同樣的擬合效果.因此，S3菌體及其EPS的Zn2＋吸附過程更適合用準(zhǔn)二級動力學(xué)方程進行描述.

表1 動力學(xué)模型擬合的相關(guān)參數(shù)Table 1 Relevant parameters fitted by dynamic models

3 結(jié)論

（1）選取實驗室前期篩選的一株對Zn2＋具有一定抗性的菌株S3，利用分子生物學(xué)手段，初步鑒定菌株S3為鞘氨醇桿菌屬.菌株S3對不同濃度的Zn2＋表現(xiàn)出不同程度的耐受性，Zn2＋對S3菌體的MIC為500 mg·L-1，為中度耐鋅細(xì)菌.

（2）菌株S3對Zn2＋具有一定的富集能力，且菌體對Zn2＋的吸附率隨著Zn2＋濃度的增大而逐漸減小.在120 min內(nèi)菌株S3非活性菌體的Zn2＋吸附能力弱于其活性菌體，并且非活性菌體可以在較短時間內(nèi)達到吸附平衡.潘建華等[24]在研究蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）對Pb2＋的吸附過程中也得到了類似的結(jié)果.

（3）參與S3菌體Zn2＋吸附過程的官能團主要有締合O-H、N-H和多糖的C-O；S3菌體EPS中的蛋白質(zhì)含量低于多糖含量.Zhang et al[25]在研究硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria）EPS對Cd2＋的吸附過程中，發(fā)現(xiàn)EPS上多糖中的官能團起主要吸附作用；許旭萍等[26]發(fā)現(xiàn)球衣菌（Sphaerotilus natans）FQ32能夠吸附Hg2＋，其原因也是菌體細(xì)胞表面有能夠與Hg2＋發(fā)生絡(luò)合的活性基團.

（4）對試驗數(shù)據(jù)進行動力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)S3菌體及其EPS對Zn2＋的吸附過程更適合用準(zhǔn)二級動力學(xué)模型進行描述，說明該過程主要為化學(xué)吸附過程.