李婷 韓榕

摘要 隨著臭氧層的變薄和臭氧空洞的出現(xiàn)，到達(dá)地球表面的 UV-B 輻射明顯提高，對(duì)生物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。擬南芥中fas1同源物的敲除也沒(méi)有使其出現(xiàn)致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發(fā)生時(shí)出現(xiàn)缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導(dǎo)致莖干寬扁， 相應(yīng)的葉序和花序結(jié)構(gòu)紊亂。因此， fas1能夠穩(wěn)定異染色質(zhì)， 使其中的基因保持沉默。以野生型和fas1 突變體擬南芥為材料，對(duì)比了不同條件下野生型和 fas1突變體擬南芥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率、根長(zhǎng)以及根尖分生區(qū)有絲分裂細(xì)胞的末期，結(jié)果表明在正常生長(zhǎng)條件下WT和 fas1 突變體的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率、根長(zhǎng)以及根尖分生區(qū)細(xì)胞在有絲分裂末期的形態(tài)都沒(méi)有顯著差異。而在 UV-B 輻射條件下，對(duì)比不同組之間的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率、根長(zhǎng)，結(jié)果表明，WT+UV-B 組低于 WT 組，fas1+UV-B 組低于fas1組，fas1+UV-B 組低于 WT+UV-B 組，且差異均達(dá)到顯著水平。此外，在UV-B 輻射條件下，觀察到在 fas1+UV-B 組中，有絲分裂也表現(xiàn)出一定的異?，F(xiàn)象。這些結(jié)果表明，fas1基因功能的缺失可能是導(dǎo)致fas1 突變體對(duì) UV-B 脅迫敏感的誘因之一。

關(guān)鍵詞 UV-B;fas1;擬南芥

中圖分類號(hào) Q947.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）17-0001-04

Abstract With the thinning of the ozone layer and the emergence of ozone holes， the UVB radiation reaching the Earths surface is significantly increased， which has a certain impact on the growth and development of organisms. The knockout of the fas1 homolog in Arabidopsis thaliana did not cause a lethal phenotype， and the plant was still alive， only when the postembryonic organ developed defects， such as activation of the silencing gene at its apical meristem， resulting in stem wide and flat， the corresponding leaf order and inflorescence structure were disordered. Therefore， fas1 was able to stabilize heterochromatin and kept the genes in silent. In this paper， the wildtype and fas1 mutants A.thaliana were used as experimental materials to compare the germination potential and germination rate， root length and the terminal phase of mitotic cells in the wildtype and fas1 mutant A.thaliana under different conditions. The results showed that there was no significant difference in germination potential，germination rate， root length and morphology of apical meristem cells at the end of mitosis under normal growth conditions. Under UVB radiation conditions， the germination potential，germination rate and root length between different groups were compared. The results showed that the WT+UVB group was lower than the WT group， the fas1+UVB group was lower than the fas1 group，the fas1+UVB group was lower than the WT+UVB group，the differences reached a significant level. In addition， under UVB radiation conditions， it was observed that mitosis also showed some anomalies in the fas1+UVB group. These results suggested that the loss of fas1 gene function may be one of the incentives for fas1 mutants to be sensitive to UVB stress.

Key words UVB;fas1;Arabidopsis thaliana

太陽(yáng)光是地球能量的主要來(lái)源，而大氣平流層中的臭氧層可以吸收太陽(yáng)光中的紫外線。20世紀(jì)以來(lái)，由于排放到大氣中的氯氟烴以及其他氮化物（如N2O等）增加，引起臭氧層的破壞，已成為人類面臨的重大環(huán)境問(wèn)題之一。臭氧層變薄及臭氧空洞的出現(xiàn)[1]，導(dǎo)致到達(dá)地面的太陽(yáng)紫外線輻射增強(qiáng);且平流層中O3每減少1%，到達(dá)地面的太陽(yáng)紫外線輻射增加2%[2]。太陽(yáng)紫外線（ultraviolet，UV）按波長(zhǎng)大小分為3種：UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）以及UV-C（100～280 nm）。由于臭氧層變薄，因而到達(dá)地面的UV-B輻射增強(qiáng)，會(huì)危害陸地植物。盡管UV-B是太陽(yáng)光中最少的成分，其在到達(dá)地表的光中占不到0.5%，但它是太陽(yáng)光光譜中能量最高的，對(duì)生物有十分重要的影響[3]。

在植物利用太陽(yáng)光進(jìn)行光合作用的同時(shí)，它們也經(jīng)受UV-B輻射的增強(qiáng)，這種能量輻射對(duì)植物形態(tài)學(xué)建成、生理及物質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架和細(xì)胞周期都有重要影響。增強(qiáng)UV-B輻射后，小麥幼苗葉片和根中微管蛋白含量減少，根尖細(xì)胞中微管周期雖然存在，但其結(jié)構(gòu)紊亂，紡錘體微管損傷嚴(yán)重影響染色體與紡錘體的結(jié)合，干擾染色體的遷移等;此外，在根尖細(xì)胞有絲分裂末期分裂異常，出現(xiàn)多核細(xì)胞，這可能與形成細(xì)胞板的成膜體微管異常相關(guān)[4]。增強(qiáng)UV-B輻射還導(dǎo)致擬南芥葉片變黃，葉片表面積減小，葉片邊緣卷曲;根長(zhǎng)的生長(zhǎng)已受到抑制[5]。在其他研究中還發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)UV-B輻射可以導(dǎo)致不同類型的DNA損傷，如形成嘧啶二聚體（CPDs）、6-4光產(chǎn)物等，進(jìn)而表現(xiàn)為染色體的異常分裂[6]。UV-B輻射會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化過(guò)程以至整個(gè)地球生態(tài)系統(tǒng)，并造成農(nóng)作物減產(chǎn)[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紫外線增強(qiáng)后植物的響應(yīng)及其分子機(jī)理研究不斷深入，研究材料主要有大豆[8]、小麥[9]、水稻、玉米[10]等重要經(jīng)濟(jì)（糧食）作物及其他植物。研究發(fā)現(xiàn)UV-B輻射增加將會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的影響[11-13]。

染色質(zhì)組裝因子1（chromatinassembly factor 1，CAF-1） 最先是從人類細(xì)胞中分離而來(lái)的，它由p150、 p60和 p48 這3個(gè)亞基組成， 在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于從酵母到人類等各種生物體中[14-16]。 在DNA 復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中， CAF-1 三聚復(fù)合體可使組蛋白 H3和H4 沉積到新合成的 DNA 上。目前， 在體外系統(tǒng)中有關(guān) CAF-1 在染色質(zhì)組裝時(shí)的功能研究有較多報(bào)道， 但其在體內(nèi)對(duì)生物發(fā)育過(guò)程影響的相關(guān)研究較少。酵母中的CAF-1 由 CAC1（chromatin assembly complex 1）、CAC2 和 CAC3 組成。研究表明，CAC基因并不影響酵母的存活， 但是其中任何一個(gè)基因的缺失都會(huì)增加酵母對(duì)紫外輻射的敏感性， 且會(huì)激活端粒 DNA 側(cè)翼基因， 使其不再沉默。 在擬南芥中， CAF-1 的同源蛋白質(zhì)有 FAS1（fasciata 1）、FAS2和 MSI1（multicopy suppressor of IRA1）。與酵母中的研究結(jié)果相似， 擬南芥中 CAF-1 同源物的敲除也沒(méi)有使其出現(xiàn)致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發(fā)生時(shí)出現(xiàn)缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導(dǎo)致莖干寬扁， 相應(yīng)的葉序和花序結(jié)構(gòu)紊亂。因此， CAF-1 能夠穩(wěn)定異染色質(zhì)， 使其中的基因保持沉默[17]。

在酵母和擬南芥中， CAF-1 敲除都沒(méi)有導(dǎo)致植物出現(xiàn)致死表型的現(xiàn)象， 似乎說(shuō)明 CAF-1 對(duì)于真核生物的發(fā)育并非必不可少。然而， 近期對(duì)動(dòng)物的研究卻表明， CAF-1 對(duì)動(dòng)物的發(fā)育是必需的。 果蠅中，去除果蠅 dCAF-1 的最大亞基 p180， 導(dǎo)致突變體發(fā)育至幼蟲(chóng)期后死亡， 去除母型 dCAF-1 p180 的活性導(dǎo)致卵子發(fā)生受阻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， dCAF-1 對(duì)于果蠅幼蟲(chóng)的核內(nèi)周期（endocycle）是必需的[17]。 在斑馬魚(yú)中， CAF-1 的中等亞基 CAF-1b 的活性降低， 導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞分化異常以及某些器官發(fā)育障礙， 特別是視網(wǎng)膜、頂蓋、胸鰭和頭骨等的發(fā)育出現(xiàn)缺陷。視網(wǎng)膜前體細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的 S 期， 之后這些細(xì)胞發(fā)生凋亡。由于降低 P53基因的活性可以挽救細(xì)胞凋亡但不能挽救細(xì)胞分化的缺陷， 因此， CAF-1 的活性對(duì)于這些器官中細(xì)胞周期的進(jìn)程和分化起著非常重要的作用。爪蟾 p150活性的降低使得胚胎發(fā)育停滯在中囊胚過(guò)渡（MBT）之前， 表現(xiàn)為細(xì)胞周期進(jìn)程異常， 說(shuō)明其對(duì) MBT 之前快速細(xì)胞周期的正常進(jìn)程是必要的[17]。對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠的研究表明， 去除 CAF-1 p150 的純合突變體胚胎發(fā)育停止于 16-細(xì)胞期， 其中組成型異染色質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重改變。因此， CAF-1 對(duì)于細(xì)胞核中染色體建立正確的空間結(jié)構(gòu)是必需的。

筆者在增強(qiáng)UV-B輻射條件下，以擬南芥野生型Col0和突變體fas1為材料，通過(guò)分析發(fā)芽率、根長(zhǎng)、RT-PCR、根尖分生區(qū)有絲分裂，以期探討fas1基因在擬南芥有絲分裂過(guò)程中的功能，為fas1在有絲分裂過(guò)程中的機(jī)制研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料 野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype）為植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。fas1（At1G65470）基因的T-DNA插入突變體fas1，編號(hào)為Salk_09467，購(gòu)自擬南芥資源中心NASC。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng)。

將擬南芥種子放到離心管中，加適量純凈水，4 ℃冰箱中避光春化3 d后，用1%的NaClO溶液消毒12 min，用無(wú)菌水沖洗5次，每次1 min;向離心管中加入0.1%瓊脂水使種子懸浮并點(diǎn)種在滅過(guò)菌的1/2 MS固體培養(yǎng)基上（2.37 g/L MS 固體粉末，1.5%蔗糖，0.8%瓊脂，pH 58～6.0）。對(duì)照組轉(zhuǎn)到22 ℃/18 ℃（光照/黑暗）、16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度6 000～8 000 lx 的環(huán)境中培養(yǎng) 7 d ;UV-B脅迫處理組，參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]的方法，具體如下：取正常培養(yǎng)的Col-0和eb1c植株為材料，從點(diǎn)種后第1天開(kāi)始，轉(zhuǎn)移到紫外燈泡下，每天08：00～10：00在固定計(jì)量[2 W/（m2·d）]的紫外強(qiáng)度下處理2 h，其余時(shí)間與對(duì)照組處理相同。

1.2.2 DNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

取擬南芥基部1 cm2大小的健康葉片3～5片，液氮研磨。加400 μL Extraction Buffer混勻，65 ℃溫育10 min。加150 μL KAC（3 mol/L，pH4.8），混勻，冰浴20 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清到新離心管。加等體積異丙醇，約400 μL，混勻數(shù)次，立即室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清留沉淀。沉淀用75%乙醇清洗，室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清，倒扣，晾干。加30 μL ddH2O溶解所提DNA。

根據(jù)http：//signal.Salk.edu/tdnaprimers.2.html網(wǎng)站上查到 Salk_009467的 T-DNA 插入位點(diǎn)信息， 設(shè)計(jì)基因特異引物fas1-LP和fas1-RP與T-DNA的LBa1.3，引物序列見(jiàn)表1。以基因組DNA為模板，分別以fas1-LP/fas1-RP和LBa1.3/fas1-RP為引物，以Col-0野生型和突變體擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用 Easy Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：Taq DNA聚合酶0.1 μL、5×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL、10 μmol/L? fas1-LP/fas1-RP和fas1-RP/LBa1.3各4 μL、模板1 μL、ddH2O 7.3 μL。PCR反應(yīng)條件為 98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 30 s，72? ℃ 1? min 10 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無(wú)目的條帶。

1.2.3 RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

采用Trizol法提取擬南芥RNA，具體如下：稱取0.1 g擬南芥葉片，液氮研磨，放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL Trizol，劇烈振蕩15 s，靜置10 min。加入預(yù)冷的氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s，靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，液體分3層，取最上面一層，加等體積預(yù)冷的異丙醇。4 ℃冰箱放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，留白色膠狀沉淀。沉淀用預(yù)冷的75%乙醇清洗2次，每次2 min，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min。加入30～40 μL的DEPC處理水溶解，并對(duì)初步提取的RNA用NanoDrop測(cè)量濃度并跑膠。取20～50 μg 進(jìn)行純化處理后加30～40 μL的DEPC處理水溶解，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以目的基因fas1擴(kuò)增引物fas1-FP和fas1-RP為RT-PCR的引物，以擬南芥actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL： PrimeSTAR 10 μL、fas1-FP/fas1-RP各1 μL、模 板 1 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 5 s，72 ℃ 2 mim 30 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無(wú)目的條帶。

1.2.4 擬南芥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)。

種子萌發(fā)的測(cè)定方法參照宋松泉等[18]進(jìn)行。具體方法如下：將擬南芥種子點(diǎn)種在1/2MS培養(yǎng)基上，從第2天開(kāi)始， 每24 h統(tǒng)計(jì)1次種子萌發(fā)情況。每組各統(tǒng)計(jì)100粒， 連續(xù)統(tǒng)計(jì)5 d，試驗(yàn)重復(fù)3次。第3天計(jì)算各組發(fā)芽勢(shì)， 第6天計(jì)算各組發(fā)芽率，分別按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

發(fā)芽勢(shì)（Ge）=（前3 d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽率（Gr）=（前6 d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥fas1突變體植株的鑒定 由圖1可知，fas1定位于擬南芥基因組的第 Ⅰ 號(hào)染色體上，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成。根據(jù)TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）提供的信息，fas1突變體的T-DNA的插入位點(diǎn)在第5個(gè)內(nèi)含子上，并設(shè)計(jì)合適的引物。

圖2a為fas1突變體的DNA水平鑒定的PCR結(jié)果，1、2、

3號(hào)植株為待鑒定的突變體植株，4號(hào)植株為野生型。1、2、3

號(hào)植株分別用fas1-LP/fas1-RP引物未擴(kuò)增出目的條帶，如圖2 a 1、3、5所示;同時(shí)用T-DNA 邊界引物 LBa1.3/fas1-RP均擴(kuò)增出目的片段，如圖2 a 2、4、6所示，表明有T-DNA 插入。4號(hào)植株為野生型（WT）植株對(duì)照，用 fas1-LP/fas1-RP引物有擴(kuò)增條帶，如圖2 a 7所示;而T-DNA邊界引物L(fēng)Ba13/fas1-RP未擴(kuò)增出條帶，如圖2 a 8所示，表明沒(méi)有T-DNA插入。初步表明3株苗均為fas1突變體T-DNA插入純合突變體。

圖2b為fas1突變體的RNA水平鑒定的PCR結(jié)果，1號(hào)植株為野生型，2號(hào)植株為待鑒定的fas1突變體植株。用內(nèi)參基因actin的引物擴(kuò)增時(shí)，1號(hào)和2號(hào)植株結(jié)果一致，均有目的條帶，如圖2 b 1、2所示。而用fas1-LP/fas1-RP引物擴(kuò)增時(shí)，1號(hào)植株擴(kuò)增出2 448 bp的fas1條帶，2號(hào)植株未擴(kuò)增出目的條帶，如圖2 b 3、4所示，表明2號(hào)植株有 T-DNA插入，而1號(hào)野生型擬南芥沒(méi)有 T-DNA 插入。進(jìn)一步確定4號(hào)植株為fas1突變體純合植株。

2.2 UV-B處理對(duì)擬南芥發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

UV-B輻射處理對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，fas1組擬南芥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均低于對(duì)照組WT，分別降低了1.33%和0.66%，但是都沒(méi)有達(dá)到顯著水平（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都低于WT組，分別降低了12.62%和8.96%，而且都達(dá)到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都低于fas1組，分別降低了15.32%和10.01%，且都達(dá)到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都低于WT+UV-B組，分別降低了4.37%和1.80%，且都達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。由此可知，UV-B輻射對(duì)fas1突變體發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響大于對(duì)野生型擬南芥的影響。

2.3 UV-B處理對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的影響

UV-B輻射處理對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖3所示，在正常生長(zhǎng)條件下，WT和fas1突變體擬南芥的根長(zhǎng)差異不顯著（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B根長(zhǎng)低于WT組，且差異顯著（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的根長(zhǎng)低于fas1組，且達(dá)到了顯著水平;而fas1+UV-B組與WT+UV-B組的根長(zhǎng)有差異，且達(dá)到了顯著水平。由此可知，UV-B輻射對(duì)擬南芥fas1突變體根長(zhǎng)的影響大于對(duì)野生型擬南芥根長(zhǎng)的影響。

2.4 UV-B處理對(duì)擬南芥根尖有絲分裂的影響

為了對(duì)UV-B輻射條件下fas1突變體的根尖有絲分裂進(jìn)行觀察，對(duì)fas1突變體植株和野生型植株根尖進(jìn)行DAPI染色，使用激光共聚焦觀察根尖分生區(qū)細(xì)胞的有絲分裂（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬南芥fas1突變體根尖分生區(qū)細(xì)胞中都有疑似異常有絲分裂現(xiàn)象的發(fā)生。

3 討論

在面對(duì)惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)， 固著生長(zhǎng)的陸生植物不能像動(dòng)物那樣通過(guò)逃離來(lái)保護(hù)自己，因此它們進(jìn)化出精細(xì)、有效的機(jī)制來(lái)抵抗和適應(yīng)外界各種各樣的逆境脅迫刺激。部分或全部的生長(zhǎng)抑制是植物對(duì)極端環(huán)境的一種適應(yīng)[19]。很多與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要功能基因往往也參與逆境脅迫響應(yīng)及適應(yīng)過(guò)程中的生長(zhǎng)調(diào)整過(guò)程， fas1就是這樣一個(gè)參與細(xì)胞有絲分裂過(guò)程的重要功能基因。對(duì)fas1突變體在UV-B脅迫下表型分析和觀察根尖分生區(qū)異常有絲分裂表明，fas1基因在擬南芥發(fā)育過(guò)程中參與了UV-B脅迫反應(yīng)。

首先通過(guò)DNA和RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體表明，與野生型相比，fas1突變體中FAS1蛋白的表達(dá)量明顯低于野生型。在UV-B脅迫條件下，fas1突變體擬南芥種子的發(fā)芽率和根長(zhǎng)均低于野生型。之前的報(bào)道稱，當(dāng)輻射劑量高于1.0 kJ/m2時(shí)，擬南芥種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和株高、根長(zhǎng)均受到抑制[20]。因此，fas1基因在擬南芥萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段有重要作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，在UV-B脅迫條件下，與野生型相比，擬南芥fas1突變體根尖分生區(qū)有絲分裂表現(xiàn)為微核和不均等分裂。而之前有報(bào)道稱，在植物fas1突變體中，根有肉眼可見(jiàn)的彎曲表型，且在有絲分裂后期呈現(xiàn)落后染色體。因此，fas1在擬南芥根尖分生區(qū)的有絲分裂過(guò)程中具有重要作用。

然而對(duì)fas1在植物染色體分離過(guò)程中的具體作用卻知之甚少。與此同時(shí)，fas1在UV-B條件下的功能以及fas1如何參與調(diào)節(jié)UV-B條件下染色體的分離還需要進(jìn)一步的研究。

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