孫悅，楊柳，史弘毅，李安琪，戴綺夢，金思伊，高海濤

（溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035）

鄰苯二甲酸酯類（phthalates，PEs）是環(huán)境雌激素，其作為塑化劑應(yīng)用于塑料制品，在生活中廣泛存在。根據(jù)國標(biāo)GB9685-2016，某些PEs在食品接觸塑料材料中的最大使用量高達(dá)43%[1]。PEs易從塑料中逸出，使人暴露其中。據(jù)報(bào)道，我國人群總PEs暴露水平為23～159 μg·kg-1·d-1，可能處在風(fēng)險(xiǎn)中[2]。研究表明，PEs暴露可致動(dòng)物生殖功能損傷[3]，與男性生殖功能障礙相關(guān)[4]。PEs暴露具有多種類、長期、低劑量的特點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)，PEs混合物（MIXPs）長期低劑量暴露可致大鼠雄性生殖功能損傷[5-6]。鋅與生殖功能和精子生成密切相關(guān)，鋅缺乏可致雄性生殖功能損傷[7-8]；而鋅干預(yù)可抑制氟、鋁暴露所致的雄性生殖毒性[9-10]，提示鋅可能對(duì)PEs暴露誘導(dǎo)的雄性生殖功能損傷有保護(hù)作用。本研究模擬人群PEs暴露的實(shí)際特點(diǎn)，探討了鋅對(duì)MIXPs暴露誘導(dǎo)小鼠雄性生殖毒性的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸正二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）和分析純均購于上海阿拉丁公司；ZnSO4·7H2O購于北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠睪酮（T）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。EnSpire酶標(biāo)儀為德國珀金埃爾默公司產(chǎn)品，ECLIPSE Ti-E倒置顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品，IKA T10高速分散器為德國IKA公司產(chǎn)品，Centrifuge 5417R離心機(jī)為德國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 MIXPs為3 種PEs的等毒性混合物，根據(jù)其每日可耐受攝入量（TDI）值[2]，按BBP:DBP:DEHP=10:5:1 的質(zhì)量比等毒性混合。以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液為賦形劑，配制MIXPs懸濁液。36 只雄性ICR小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，1 月齡，SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中經(jīng)過1 周適應(yīng)環(huán)境后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組12只。MIXPs組小鼠經(jīng)口灌胃MIXPs 160 mg·kg-1·d-1；MIXPs+ZnSO4組經(jīng)口灌胃MIXPs 160 mg·kg-1·d-1，同時(shí)經(jīng)口給予ZnSO450 mg·kg-1·d-1；對(duì)照組每天經(jīng)口灌胃等容量0.5% CMC-Na；連續(xù)干預(yù)90 d，記錄動(dòng)物的精神狀態(tài)。干預(yù)處理結(jié)束后，禁食8 h，麻醉后眶靜脈取血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，超低溫保存?zhèn)溆?。引頸處死小鼠，測量體長和肛殖距，解剖，取睪丸、睪丸脂肪、精囊、附睪，稱質(zhì)量。取適量臟器組織，液氮冷凍后，移至-80 ℃凍存，備用。

1.3 精子畸形率檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，取小鼠兩側(cè)附睪，37 ℃水浴條件下加入1 mL PBS并剪碎，制成精子懸液，取0.5 mL精子懸液加入1.5 mL PBS，四層擦鏡紙濾除組織碎片，濾液以1 000 r/min離心5 min。吸去上清液，剩余少量液體與沉淀搖勻后，制片，干燥，甲醇固定5 min，晾干，2%伊紅水溶液染色1 h，蒸餾水淋洗。晾干，200倍顯微鏡下觀察精子形態(tài)，記錄畸形數(shù)，計(jì)算精子畸形率。

1.4 臟器組織勻漿液制備 取超低溫凍存的睪丸組織0.1 g，按1:10加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液，剪碎，冰水浴中勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，儲(chǔ)存于冰水混合物中，備用。BCA蛋白測定試劑盒測定其中的蛋白質(zhì)水平。

1.5 睪酮及睪丸組織抗氧化水平檢測 取上述血清和睪丸組織上清液適量，按照小鼠睪酮ELISA試劑盒使用說明檢測血清和睪丸組織中的睪酮水平。按照SOD、MDA、T-AOC試劑盒的使用說明測定睪丸組織中SOD、MDA、T-AOC水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠一般情況比較 對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛油亮順滑，較活躍；MIXPs組精神稍萎靡，部分小鼠生殖器周圍毛色泛黃，皮毛粗糙；MIXPs+ZnSO4組小鼠精神狀態(tài)相對(duì)較好，個(gè)別小鼠生殖器周圍毛色泛黃，皮毛略有粗糙。3組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)期間均呈增長趨勢；解剖時(shí)MIXPs組小鼠體質(zhì)量較對(duì)照組明顯降低，而MIXPs+ZnSO4組較MIXPs組顯著升高（均P＜0.05）。與對(duì)照組比，MIXPs組體長和肛殖距顯著降低（P＜0.05）；而與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組體長并無顯著改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與MIXPs組比，MIXPs+ZnSO4組肛殖距顯著增長（P＜0.05）。見圖1。

2.2 3 組小鼠雄性器官質(zhì)量比較 與對(duì)照組比，MIXPs組小鼠睪丸周圍脂肪組織質(zhì)量明顯下降（均P＜0.05）；而與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組睪丸、睪丸周圍脂肪、附睪、精囊質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與MIXPs組比，MIXPs+ZnSO4組睪丸周圍脂肪量顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖1 3組小鼠體質(zhì)量增長曲線以及解剖時(shí)的體質(zhì)量、體長、肛殖距比較

圖2 3組小鼠的睪丸、睪丸周圍脂肪組織、附睪、精囊質(zhì)量比較

2.3 3組小鼠精子畸形率和形態(tài)比較 精子畸形率：對(duì)照組為10.42%，MIXPs組為52.25%，MIXPs+ZnSO4組為18.59%。與對(duì)照組比，MIXPs組小鼠精子畸形率顯著升高（P＜0.01）；與MIXPs組比，MIXPs+ZnSO4組精子畸形率顯著降低（P＜0.01）；而與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組小鼠精子形態(tài)正常，精子頭部有鉤，尾部健壯，見圖3A；MIXPs組精子形態(tài)表現(xiàn)為自身折疊、斷尾、尾部瘦弱等，見圖3B；MIXPs+ZnSO4組精子形態(tài)幾乎與正常無差別，見圖3C。

圖3 3組小鼠精子形態(tài)比較（伊紅Y染色）

2.4 3組小鼠血清和睪丸組織睪酮水平比較 與對(duì)照組比，MIXPs組血清睪酮水平顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但顯著高于MIXPs組（P＜0.05）。3組間睪丸組織睪酮水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

2.5 3組睪丸組織抗氧化指標(biāo)檢測比較 與對(duì)照組比，MIXPs組睪丸組織SOD水平顯著降低（P＜0.01）；與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與MIXPs組比，MIXPs+ZnSO4組顯著升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比，MIXPs組睪丸組織MDA水平顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比，MIXPs+ZnSO4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與MIXPs組比，MIXPs+ZnSO4組顯著升高（P＜0.05）。3組小鼠間均睪丸組織T-AOC水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖4 3組小鼠血清和睪丸組織睪酮水平比較

圖5 3組小鼠睪丸組織中SOD、MDA和T-AOC水平比較

3 討論

本研究模擬人群長期低劑量混合物暴露的實(shí)際特征，研究了BBP、DBP、DEHP 3種常見PEs塑化劑的等毒性混合物的雄性生殖毒性，以及鋅對(duì)MIXPs暴露致雄性生殖毒性的干預(yù)作用。根據(jù)前期研究[5，10]，設(shè)定MIXPs的暴露劑量為160 mg·kg-1·d-1，ZnSO4的干預(yù)劑量為50 mg·kg-1·d-1。處理90 d發(fā)現(xiàn)MIXPs暴露改變了小鼠生殖器官質(zhì)量、肛殖距、血清睪酮水平及精子形態(tài)等，產(chǎn)生了生殖毒性；而鋅能夠抑制這些參數(shù)的改變，從而抑制MIXPs的生殖毒性。

本研究干預(yù)過程中發(fā)現(xiàn)，MIXPs組小鼠精神稍萎靡，活躍性降低，個(gè)別小鼠生殖器周圍毛色泛黃，皮毛粗糙，體質(zhì)量降低，身長縮短，提示MIXPs暴露對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性作用；這與前期研究[5]結(jié)果相一致；而MIXP+ZnSO4組小鼠這些參數(shù)均無明顯的變化。另一方面，臟器質(zhì)量的顯著改變是機(jī)體出現(xiàn)損傷的重要指標(biāo)[12]。睪丸周圍脂肪可保護(hù)睪丸免受傷害。肛殖距與生殖功能呈正相關(guān)，肛殖距是生殖功能損傷的敏感性指標(biāo)。本研究中，MIXPs組肛殖距明顯縮短，睪丸周圍脂肪含量降低，說明MIXPs暴露對(duì)大鼠產(chǎn)生了生殖毒性。精子形態(tài)觀察和顯著提升的精子畸形率佐證了MIXPs的雄性生殖毒性。本研究中，MIXPs+ZnSO4組小鼠肛殖距、睪丸周圍脂肪較MIXPs組均有明顯增加，精子形態(tài)改善，精子畸形率顯著降低，說明鋅對(duì)MIXPs暴露誘導(dǎo)的生殖毒性有抑制作用。在CHEMEK等[13]的研究中，鋅能夠提高妊娠期及哺乳期鎘暴露致子一代雄性大鼠的生殖器官的相對(duì)質(zhì)量，如睪丸和附睪，對(duì)大鼠雄性生殖系統(tǒng)有保護(hù)作用，與本研究結(jié)果類似。

睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強(qiáng)度、維持雄性第二特征和生殖功能、增強(qiáng)免疫力等作用。據(jù)報(bào)道，PEs暴露能夠降低血清睪酮水平[14-15]，其原因可能是：PEs暴露下調(diào)了一些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如StAR、P450scc、CYP17、17β-HSD和3β-HSD，從而抑制睪酮的合成[16-17]。本研究結(jié)果顯示，MIXPs組小鼠睪丸組織睪酮水平未發(fā)生明顯變化，提示MIXPs暴露可能沒有影響小鼠的睪酮合成；而MIXPs組小鼠血清睪酮水平顯著降低，提示MIXPs暴露可能影響了睪酮的分泌，這可能與下丘腦-垂體-睪丸軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)[5]。睪酮維持著精子的正常發(fā)育，而血清睪酮水平降低可能是MIXPs組小鼠精子畸形率升高的內(nèi)在原因。MIXPs+ZnSO4組小鼠血清睪酮水平較MIXPs組有顯著的提升，提示鋅可抑制MIXPs暴露致血清睪酮水平改變，從而維持小鼠正常的雄性生殖功能。

諸多研究顯示，PEs暴露可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，對(duì)雄性生殖功能造成損傷。研究表明，DBP（250～500 mg·kg-1·d-1）經(jīng)口暴露2周可致大鼠附睪組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、SOD活性降低，MDA水平升高，誘導(dǎo)附睪損傷[18]。類似的，DBP（100～500 mg·kg-1·d-1）腹腔注射致睪丸組織氧化應(yīng)激，干擾大鼠性激素合成、精子生成，損傷其生殖能力[19]。DEHP（50、150、450 mg·kg-1·d-1）經(jīng)口連續(xù)暴露2周致睪丸組織中SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSH-Px以及T-AOC降低，MDA水平升高，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對(duì)大鼠雄性生殖系統(tǒng)造成損傷[20]。本研究中，MIXPs組小鼠睪丸組織中SOD、MDA水平均顯著降低，而T-AOC無顯著改變，提示MIXPs暴露可能導(dǎo)致小鼠抗氧化體系紊亂，使氧自由基水平增加，從而對(duì)睪丸組織造成損傷。MIXPs+ZnSO4組小鼠睪丸組織各抗氧化指標(biāo)較對(duì)照組均無明顯改變，提示鋅能夠改善小鼠的抗氧化體系，從而保護(hù)睪丸組織免受氧自由基的攻擊。

綜上所述，MIXPs長期暴露可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激，血清睪酮水平降低，導(dǎo)致精子畸形率升高，損傷其雄性生殖功能；而鋅能夠抑制MIXPs暴露誘導(dǎo)的雄性生殖功能損傷。