張教真，婁紅祥

（山東大學藥學院天然產(chǎn)物化學生物學教育部重點實驗室 濟南 250012）

苔蘚植物（bryophytes）是高等植物中最低等的類群，他們植物體矮小，無維管組織，也沒有花的結(jié)構(gòu)，在分類學上界于藻類（algae）和蕨類（pteridophytes）之間。目前世界范圍內(nèi)的苔蘚植物有約24000 種，在綠色陸地植物中，種類僅次于種子植物。它們的生命力非常強，分布廣泛，無論是高山湖泊還是極地都可以看到苔蘚植物的蹤跡[1-4]。

苔蘚植物包括為苔綱（Hepaticae，liverworts）、蘚綱（Musci，mosses）和角苔綱（Anthocerotae，hornworts）三大類群[3]。油體（oil body），是苔蘚植物中一類特殊的細胞器，外覆一層膜，僅存在于苔綱植物中（圖1）。油體的作用學術界尚有爭議，目前更為人所接受的推測是，它可以用來儲存萜類芳香類等次級代謝產(chǎn)物，并進而起到化學防御的作用[5]。這也從一個方面解釋了為何從苔類植物中分離得到的次級代謝產(chǎn)物在數(shù)量和結(jié)構(gòu)新穎程度上都遠大于其他兩類苔蘚植物。

苔類植物中的次級代謝產(chǎn)物主要以萜類和芳香類化合物為主，其中雙聯(lián)芐化合物被認為是苔類植物中的特征性成分，在其他高等植物中鮮有發(fā)現(xiàn)[2]。由于苔蘚植物植株矮小，鑒定困難，難于富集的特點，長期以來，其化學成分研究一直為人所忽略。近年來隨著分析測試儀器靈敏性和精密度的提高，苔蘚植物研究呈現(xiàn)出的復雜多樣的次級代謝產(chǎn)物，廣泛的生物活性，以及化學分類與生物合成方面的意義與規(guī)律，受到越來越多的關注。本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀以及本課題組研究進展，對苔蘚植物化學生物學研究作出總結(jié)。

1 苔蘚植物研究概述

1.1 苔蘚植物特殊的進化位點與生態(tài)意義

雖然目前學術界對最早的苔蘚化石有所爭議，但可以肯定的是，苔蘚植物是地球上出現(xiàn)最早的高等植物，明確的證據(jù)表明，苔蘚植物出現(xiàn)在陸地上的時間不會晚于距今4.75 億年的中奧陶世[6]。作為高等植物的最低等類群（圖2），苔蘚植物沒有維管組織和真正的根，但擁有陸生植物進化所有關鍵性突破：多細胞的二倍孢子體，配子體的頂端分生組織，孢子體的頂端分生組織和細胞組織分化。正是這些特征為苔蘚植物在形態(tài)和生理上適應陸地生活提供了可能?？茖W家通過分析苔蘚植物地錢模式種（Marchantia polymorpha）的基因序列發(fā)現(xiàn)，相比于輪藻（charophycean algae，陸生植物的起源），該陸生植物基因組能夠編碼全新的生物化學通路，新的植物激素信號通路，并增加了轉(zhuǎn)錄因子家族多樣性；同時，相比于其他已經(jīng)測序的陸生植物，地錢在大多數(shù)調(diào)節(jié)通路上顯示出低的遺傳冗余性，這一點與陸生植物的祖先十分相似[7]。上述研究在分子系統(tǒng)學的角度進一步證實了苔蘚是水生到陸生的過渡態(tài)植物，值得一提的是，變水特性（poidilohydric）是大部分苔蘚植物的重要特點，即苔蘚在周邊環(huán)境變得干燥后，可將體內(nèi)含水量變得很低，一旦環(huán)境條件變得潮濕，又可以迅速吸干水分，回復正常的生理代謝活動。這一特性可導致林中沼澤或湖泊逐漸變?yōu)殛懙兀瑸槠渌叩戎参锏纳L創(chuàng)造條件，也使得苔蘚在生態(tài)保護中發(fā)揮著重要作用。

圖1 苔蘚植物的三大類群與苔綱植物中不同類型的油體

圖2 苔蘚植物在植物界中的進化位置[7]

1.2 苔蘚植物化學與生物學多樣性

1.2.1 苔蘚植物的化學成分及其特性

苔蘚植物是生物活性天然產(chǎn)物的重要來源。尤其是近年來從苔類植物中分離獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的萜類、芳香類化合物，Askawa 等曾對此作出多次綜述[8-10]，現(xiàn)將苔類植物次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特點概括如下：

（1）苔類植物次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型基本覆蓋了天然產(chǎn)物的所有結(jié)構(gòu)類型，但以萜類化合物和聯(lián)芐類化合物為主。90%苔類植物含有油胞或細胞中含有油體結(jié)構(gòu)，科學家證明油體是苔類植物合成和儲存萜類化合物及聯(lián)芐類化合物的單元。

（2）苔類植物中的化合物特別是聯(lián)芐和部分萜類化合物常以二聚體或多聚體形式存在，如苔類植物中的雙聯(lián)芐、二聚倍半萜、二聚二萜等化合物。如從疏葉剪葉苔（Herbertus sakuraii）和馬來西亞產(chǎn)硬須苔（Mastigophora diclados）中分離得到的mastigophorenes A-D 為剪葉苔烷型倍半萜的二聚體。從尖瓣光萼苔（Porella acutifolia）分離得到的bisacutifolones A-C則為綠葉苔烷型倍半萜的非對稱結(jié)構(gòu)的二聚體。波瓣合葉苔（Scapania undulata）中分離的scapaundulins A-B 是半日花烷型二萜化合物的二聚體。從羽苔屬植物Plagiochila moritziana中分離得到的plagiospirolides AD為倍半萜和二萜化合物通過Diels-Alder加成反應后的產(chǎn)物。而在岐舌苔（Schistochila glaucescens）中分離得到的化合GBB A和B則是倍半萜類化合物與雙聯(lián)芐類化合物結(jié)合的二聚體。

（3）有些結(jié)構(gòu)的化合物如綠葉苔烷（pinguisane）、全萼苔烷（gymnomitrane）、小萼苔烷（myltaylane）、環(huán)小萼苔烷（cyclomyltaylane）和vitrane 型倍半萜以及sacculatane 型二萜等迄今僅在苔類植物中發(fā)現(xiàn)，而不存在于高等植物、真菌、海洋生物中。

大環(huán)雙聯(lián)芐類化合物是苔類植物的一類典型化合物，迄今已鑒定80 余個。除riccardin C 最近也從報春花屬植物Primula macrocalyx中分得外，其它所有大環(huán)雙聯(lián)芐僅在苔類植物中發(fā)現(xiàn)。

（4）與高等植物相比，苔類植物發(fā)現(xiàn)的多數(shù)倍半萜及一些二萜類化合物為高等植物中存在的相應化合物的對映異構(gòu)體，但補身烷（drimane）、吉馬烷（germacrene）和愈創(chuàng)木烷（guaiane）等型倍半萜以及松香烷（abietane）、克羅烷（clerodane）和半日花烷（labdane）等型二萜除外。

1.2.2 苔蘚植物次級代謝產(chǎn)物的生物學活性

苔蘚植物中的萜類和芳香類化合物具有廣泛的生物學活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、肌肉松弛、神經(jīng)保護、昆蟲拒食、酶抑制、殺寄生蟲、殺軟體動物及植物生長調(diào)節(jié)等。對雙聯(lián)芐類化合物抗腫瘤、抗真菌和逆轉(zhuǎn)耐藥等活性及作用機制的研究表明，該類化合物活性顯著且作用機制明確，可作為新藥開發(fā)的先導化合物（詳見第2部分）。對苔蘚植物活性成分的深入發(fā)掘表明，該類植物是活性天然產(chǎn)物的巨大寶庫，值得更加深入研究?；瘜W家與植物學家、藥理學家應密切合作，開展多學科交叉的苔蘚植物化學生物學研究，加強活性成分的篩選和作用機制研究，快速發(fā)現(xiàn)有應用價值的活性先導化合物[7-10]。

對于3 h和6 h累積降水的距平相關系數(shù)和均方根誤差的評估結(jié)果與上述24 h累積降水的結(jié)果相一致,集成之后的結(jié)果相比最優(yōu)方案有所提高。從TS評分中也發(fā)現(xiàn),集成后也稍次于最優(yōu)方案。由此發(fā)現(xiàn)通過簡單集合平均可有效地解決各種方案預報不穩(wěn)定的問題,充分發(fā)揮各種方案的優(yōu)勢,降低預報誤差,提高預報技巧。

1.3 苔蘚植物的化學分類學研究

20世紀60年代，在植物系統(tǒng)分類學與植物化學之間出現(xiàn)了一門新的交叉學科，即植物化學分類學（chemotaxonomy），又稱植物化學系統(tǒng) 學（chemosystematics），是利用化學特征，來研究植物各類群之間親緣關系，探討植物界的演化規(guī)律，即從分子水平上來研究植物分類和系統(tǒng)演化的一門學科。

與高等維管植物相比，苔蘚植物個體矮小，以致其形態(tài)鑒定與系統(tǒng)分類難度較大，因而研究其次級代謝產(chǎn)物對其分類具有重要意義。在苔蘚植物中，90%的苔類都有油體，但蘚類植物和角苔類植物中不含有油體。苔綱，蘚綱，角苔綱三綱之間的化學成分具有較大的差異，這種化學上的差異顯然支持植物分類學家對苔蘚植物劃分成苔綱，蘚綱，角苔綱的觀點。日本學者Asakawa 曾對苔蘚植物的化學分類做了詳細具體的綜述[12,13]，系統(tǒng)整理了葉苔亞綱的36個科，和地錢亞綱的7 個科的不同種屬植物的化學成分與系統(tǒng)分類的關系。本課題組在苔蘚化學生物學方面的研究也使得苔蘚植物化學分類學不斷取得新的進展。相信未來隨著對人們苔蘚植物研究的日益重視，積累的化學資料將越來越豐富，同時伴隨著分子生物學資料的積累和介入，苔蘚植物化學分類學將會取得更大的突破。

圖3 苔蘚植物中的新骨架化合物

2 本課題組在苔蘚植物化學生物學方面研究進展

2.1 苔蘚植物中特殊化學成分的研究

2.1.1 聯(lián)芐類化合物的快速發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)多樣性制備

本課題組建立了通過HPLC/TLC-MS 與生物自顯影技術相結(jié)合，快速發(fā)現(xiàn)苔蘚植物中雙聯(lián)芐類化合物的方法，發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗真菌/抗腫瘤活性的雙聯(lián)芐類化合物[14-16]。為了進一步拓展該類化合物在新藥研發(fā)方面的潛力，我們利用全合成法對四種雙聯(lián)芐類化合物地錢素C、片葉苔素D、羽苔素E 和dihydroptychantol A 進行制備，并在此基礎上通過醚化、溴代、Mannich 反應等制備一系列結(jié)構(gòu)新穎的活性衍生物[17-19]。

2.1.2 新骨架萜類化合物的發(fā)現(xiàn)

苔類植物是結(jié)構(gòu)新穎的萜類化合物的重要來源。在粗疣合葉苔（Scapania parva）中分離得到的scaparvin A[20]，在多形帶葉苔（Pallavicinia ambigua）中分離得到的pallambins A 和B[21]，在裸蒴苔（Haplomitrium mnioides）中分離得到的haplomintrins A和B[22]以及hapmnioides A-C[23]，都是本課題組在苔類植物中分離得到的骨架新穎的二萜類化合物，最近，我們在圓葉羽苔（Plagiochila duthiana）中得到了兩個骨架新穎的倍半萜類化合物plagiochianins A and B（圖3）[24]。

在尋找苔蘚植物中特殊化學成分的過程中，本課題組首次在苔蘚中發(fā)現(xiàn)光催化反應參與天然產(chǎn)物合成過程的后修飾，是天然產(chǎn)物多樣化生成的重要步驟。pallambins A 和B[25]，haplomintrins A 和B，haplomintrins D-G[26]等新骨架化合物都被證明可由已知的半日花烷型二萜經(jīng)光致重排得到。

2.1.3 活性化合物多靶點生物學研究以及活性化合物庫的建立

圖4 苔蘚植物中抑制菌絲毒力化合物高通量篩選方法

本課題組通過多種手段評價了分離得到的化合物的生物學活性，并進行相應機制研究與成藥性研究。本課題組首次發(fā)現(xiàn)雙聯(lián)芐類化合物（地錢素C 及其衍生物）為新型微管蛋白解聚劑[28]，并發(fā)現(xiàn)雙聯(lián)芐衍生物（RD-N）能夠特異性靶向溶酶體，通過亞細胞導向?qū)崿F(xiàn)了雙聯(lián)芐類化合物精準給藥，提高治療指數(shù)[29]。此外，多種萜類化合物被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤，抗炎，植物生者調(diào)節(jié)等作用[23,27,30]。在對我國逾100種苔蘚植物進行系統(tǒng)的化學生物學研究的基礎上，我們發(fā)現(xiàn)了新化合物350 余個，構(gòu)建形成了超過3000 個化合物的苔蘚化合物庫，為創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)奠定了物質(zhì)基礎

2.2 苔蘚植物化學成分抗真菌毒力研究

真菌感染發(fā)病普遍，侵襲性真菌感染死亡率更是高達40%。真菌毒力因子的表達與真菌對宿主的侵襲、感染、器官組織破壞等密切相關。抑制真菌毒力因子是發(fā)現(xiàn)新型抗真菌藥的重要策略，本課題組建立了以真菌毒力因子為靶點的抗真菌藥物篩選平臺，實現(xiàn)了抗真菌化合物的高通量篩選（圖4）。苔蘚植物具有不被真菌感染的特性，說明其體內(nèi)具有大量的抗真菌物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)苔蘚植物中的雙聯(lián)芐、萜類化合物等能過通過抑制真菌菌絲形成、抗粘附、抑制被膜形成、抑制外排泵表達等方式發(fā)揮抗真菌作用[31-34]。

以riccardin D為代表的雙聯(lián)芐類化合物能夠通過下調(diào)真菌粘附、抑制菌絲和被膜生長相關通路基因表達、改變細胞膜甾醇組成、促進Dpp3 合成Farnesol 等途徑降低真菌毒力[33]。密葉三瓣苔（Tritomaria quinquedentata）中的倍半萜類化合物ent-iLL 對CDR基因敲除的白色念珠菌表現(xiàn)出較強的抗真菌和抑制菌絲的活性，而對野生型菌無效。我們通過藥物胞內(nèi)含量測定以及ent-iLL 與CDR 抑制劑RD 聯(lián)用表現(xiàn)出更強活性，驗證了ent-iLL 是Cdrs 的底物的猜想，并通過GC-MS和RT-PCR研究了ent-iLL的抑菌機制，發(fā)現(xiàn)其能夠干擾甾醇合成來發(fā)揮其抑菌活性[34]。

2.3 苔蘚植物特殊的生物合成過程研究

苔蘚植物富含次生代謝產(chǎn)物，但是由于除小立碗蘚之外的其他苔蘚植物遺傳背景尚不清楚，加之苔蘚植物與維管植物親緣關系比較遠，根據(jù)保守序列進行基因克隆有很大困難，所以對苔蘚植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑研究最初主要依靠同位素追蹤。本課題組構(gòu)建了苔蘚植物組織培養(yǎng)體系，研究了苔蘚植物特有成分雙聯(lián)芐等生物合成過程中的關鍵酶，揭示了生物合成規(guī)律與其他高等植物的差異，提出了生物合成規(guī)律與植物進化的關系。

苔蘚植物富含聯(lián)芐類化合物，而且是最早出現(xiàn)黃酮類化合物的植物，這兩類化合物共同來源于苯丙烷途徑，起始于苯丙氨酸，在這個途徑中，苯丙氨酸裂解酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL），4-羥基肉桂酰輔酶A連接酶（p-coumarate CoA ligase,4CL），查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS），羧酸茋類合成酶（stilbenecarboxylate synthase，STCS），查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI），黃酮合成酶（flavone synthase，F(xiàn)NS）等都是關鍵酶。本課題組通過構(gòu)建苔蘚植物組織培養(yǎng)體系建立cDNA 文庫，EST 測序，轉(zhuǎn)錄組測序等方法，獲得了這些關健酶基因及調(diào)控這些基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，并鑒定了其功能，為下一步通過代謝工程生產(chǎn)這些化合物奠定了基礎。通過研究雙聯(lián)芐的生物合成規(guī)律，發(fā)現(xiàn)苔蘚植物中的雙聯(lián)芐和陸地其他高等植物中的黃酮擁有共同的起始生源，關鍵的STCS 合成酶的結(jié)構(gòu)微小差異造成了苔蘚植物中生成聯(lián)芐。而其他高等植物合成黃酮的巨大差異，這對揭示苔蘚植物的進化規(guī)律具有重要的意義[35-39]。

最近，本課題組對苔類植物CHI 的功能及進化進行了深入研究研究。傳統(tǒng)觀點認為，有催化功能的CHI 僅存在于維管植物中，I 型CHI 在植物界普遍存在，而具有更廣泛底物選擇性的Ⅱ型CHI 僅存在于豆科植物中，而且是由I 型CHI 經(jīng)基因復制而來，是更為晚期的進化事件。我們通過分析苔類植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和江南卷柏基因組測序數(shù)據(jù)，篩選到查爾酮異構(gòu)酶CHI家族基因進行研究，通過進化樹分析，體外生化實驗及體內(nèi)遺傳學實驗證明苔類植物和江南卷柏不含有I型CHI，而是普遍含有II型CHI，能以柚皮素查爾酮為底物生成柚皮素，還能將異甘草素轉(zhuǎn)變成甘草素，這是首次證明Ⅱ型CHI 在非豆科植物中存在，同時也證明非維管植物中含有有功能的CHI。這些結(jié)果更新了關于查爾酮異構(gòu)酶進化的認識，表明有功能查爾酮異構(gòu)酶的出現(xiàn)是一個古老的事件，發(fā)生在苔蘚植物種群出現(xiàn)之前[40]。

3 結(jié)語

正如古詩文中所說的“苔花如米小，也學牡丹開”，雖然苔蘚沒有真正的花，人們看到的只是它的苞蒴。但對苔蘚的化學和生物學研究已經(jīng)表明，苔蘚中的化學成分以及其生物意義并不比高等植物遜色。相信未來，隨著化學，藥理學，植物學等多學科共同研究的不斷深入，會讓更多的人看到苔蘚植物的光彩與價值。