黃旭龍，郝俊杰，徐 鋒，王祥培，吳紅梅

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 貴陽 550025）

西瓜皮又稱西瓜翠衣，為葫蘆科植物西瓜的外層果皮，性涼，味甘，無毒，入脾、胃二經(jīng)，具有清熱解暑，止渴，利小便之功效，用于防治暑熱煩渴、小便短少、水腫、口舌生瘡等[1]。我國作為西瓜生產(chǎn)大國之一，每年有約占西瓜總量1/3 的西瓜皮被隨意丟棄，不僅造成環(huán)境污染，而且導(dǎo)致巨大的資源浪費(fèi)，如何充分利用這些資源，將其變廢為寶，開發(fā)出具有高附加值的產(chǎn)品，已經(jīng)成為全社會關(guān)注的熱點(diǎn)問題。目前，西瓜皮已廣泛應(yīng)用于食品、飲料、藥物等領(lǐng)域[2-6]；現(xiàn)代研究表明，其含有豐富的營養(yǎng)與保健成分，主要包括果膠、維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸，多糖等[7-11]，而這些成分具有防治高血壓、腎炎、肝炎、糖尿病、黃疸等藥理作用[12-16]?！冬F(xiàn)代實(shí)用中藥》將其作為利尿劑，用于治療糖尿病，腎臟炎浮腫，黃疸；《本草綱目》、《飲膳正要》均有記載，以西瓜皮煎湯代茶飲或西瓜皮、冬瓜皮、天花粉水煎用于防治消渴，而中醫(yī)把糖尿病歸屬于消渴癥的范疇[17]。但目前有關(guān)西瓜皮防治糖尿病的研究鮮有報(bào)道，而從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行系統(tǒng)全面的闡述西瓜皮防治糖尿病的作用機(jī)制未見報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，為揭示復(fù)雜藥物作用機(jī)制提供新的思路和方法，與中藥“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的特點(diǎn)不謀而合[18-23]。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對西瓜皮活性營養(yǎng)成分中可能防治糖尿病的作用靶點(diǎn)以及信號通路進(jìn)行分析，以期探討西瓜皮防治糖尿病的分子機(jī)制，為西瓜皮資源的開發(fā)利用及深入研究提供參考。技術(shù)路線（圖1）。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的西瓜皮營養(yǎng)成分防治糖尿病分子作用機(jī)制的技術(shù)路線

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)的建立

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)（CNKI、PubMed）及結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫、PubChem 數(shù)據(jù)庫、TCMID 數(shù)據(jù)庫等，以藥效活性或ADME 參數(shù)（OB ≥30%和DL ≥0.15）為指標(biāo)，篩選西瓜皮中所含的活性營養(yǎng)成分及結(jié)構(gòu)，再運(yùn)用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，以Score cutoff（＞35）得分及Pvalue（P＜0.05）值等為指標(biāo)，篩選西瓜皮活性營養(yǎng)成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。再依據(jù)相似性比較，通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（HIT，http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）進(jìn)行活性成分潛在靶點(diǎn)的篩選，建立活性成分潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集；并通過人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.omim.org/）篩選西瓜皮防治糖尿病的基因和蛋白靶點(diǎn)，建立糖尿病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。人類的靶點(diǎn)連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//dip.doe-mbi.ucla.edu）獲得。最后將篩選得到的所有靶點(diǎn)均經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫查詢轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了闡明西瓜皮中活性營養(yǎng)成分與糖尿病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)分析。通過PPI（http：//www.genome.jp/kegg/）分析，將西瓜皮的營養(yǎng)成分、成分對應(yīng)的靶點(diǎn)、糖尿病對應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對應(yīng)的靶點(diǎn)連接成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)[24,25]。利用Cytoscape 3.6.1軟件將以上網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，得到每個節(jié)點(diǎn)的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三個拓?fù)鋮?shù)通過CentiScaPe 1.2 進(jìn)行評估，選擇以上3個拓?fù)鋮?shù)值滿足分別大于所有點(diǎn)中位數(shù)值的靶點(diǎn)，作為西瓜皮防治糖尿病的目標(biāo)靶點(diǎn)。

1.3 生物過程分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對所篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作關(guān)系分析，最后對篩選的目標(biāo)靶點(diǎn)使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路分析和GO（Gene Ontology）生物學(xué)過程分析。

1.4 構(gòu)建西瓜皮防治糖尿病通路圖

將西瓜皮與糖尿病相關(guān)聯(lián)的目標(biāo)靶點(diǎn)導(dǎo)入KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，得到目標(biāo)靶點(diǎn)在與糖尿病相關(guān)通路上的標(biāo)注圖，驗(yàn)證西瓜皮通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮防治糖尿病的作用。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的篩選

通過查閱文獻(xiàn)及結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫，共得到8 個成分滿足篩選條件（表1）。通過Cytoscape 軟件篩選出602 個交互蛋白；通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建出西瓜皮防治糖尿病作用的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同顏色和形狀圖形使其可視化后，可直觀的看出營養(yǎng)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖2）。其中，黃色方形代表藥物與疾病都作用的靶點(diǎn)，也是西瓜皮防治糖尿病最重要的靶點(diǎn)蛋白；黃色圓點(diǎn)代表糖尿病直接作用靶點(diǎn)；紅色三角形代表西瓜皮中的被預(yù)測出的活性化合物；藍(lán)色圓點(diǎn)代表西瓜皮營養(yǎng)成分的直接作用靶點(diǎn)；紫色圓點(diǎn)代表連接西瓜皮成分與疾病靶點(diǎn)的交互蛋白。

2.2 西瓜皮營養(yǎng)成分防治糖尿病直接作用靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析

通過對Cytoscape交互網(wǎng)絡(luò)分析，得到西瓜皮活性營養(yǎng)成分相關(guān)聯(lián)的蛋白靶點(diǎn)，并對這些蛋白靶標(biāo)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)計(jì)算。以網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的（Degree、Betweenness centrality 和Closeness centrality）中位數(shù)均值作為計(jì)算結(jié)果，得到三個拓?fù)鋮?shù)分別為：4、0.01和0.174。選擇靶點(diǎn)中每個靶點(diǎn)的三個拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)均值的靶點(diǎn)作為西瓜皮防治糖尿病的重要靶點(diǎn)蛋白，最終篩選出22 個靶點(diǎn)滿足以上條件（表2）。篩選出靶點(diǎn)的蛋白互作關(guān)系（圖3），蛋白相互作用關(guān)系說明篩選出西瓜皮活性營養(yǎng)成分對防治糖尿病的作用蛋白相互關(guān)聯(lián)和彼此調(diào)節(jié)。

表1 西瓜皮活性營養(yǎng)成分結(jié)構(gòu)及靶標(biāo)數(shù)

2.3 GO生物學(xué)功能分析

為了闡明西瓜皮防治糖尿病作用的分子機(jī)制，對其差異基因進(jìn)行了GO生物過程富集分析。將22個潛在靶點(diǎn)映射到DAVID 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行生物學(xué)功能富集，系統(tǒng)的分析其生物過程。共富集到156 條生物過程，其中P值≤0.01 的生物過程共有54 條（圖4，表3）。結(jié)果表明，這些靶點(diǎn)與多種生物過程相關(guān)，主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、晝夜節(jié)律、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB 活性的負(fù)調(diào)控等生物過程進(jìn)行調(diào)控，且這些生物過程與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也反映了糖尿病發(fā)病機(jī)制涉及體內(nèi)多個生物過程的異常，同時也表明西瓜皮可能是通過調(diào)節(jié)這些生物過程發(fā)揮防治糖尿病作用。

2.4 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書）通路分析

圖2 西瓜皮活性營養(yǎng)成分防治糖尿病作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

表2 西瓜皮營養(yǎng)成分防治糖尿病的直接作用靶點(diǎn)相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

圖3 西瓜皮營養(yǎng)成分對防治糖尿病的蛋白靶標(biāo)互作關(guān)系圖

圖4 西瓜皮防治糖尿病作用的GO生物學(xué)功能富集分析部分結(jié)果圖

通過KEGG通路富集分析，篩選出31（P＜0.01）條通路與西瓜皮防治糖尿病的作用相關(guān)，其主要通路結(jié)果（圖5，表4）。其中Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Chronic myeloid leukemia、Hepatitis B 等通路都顯示出具有直接或間接參與防治糖尿病的作用，此結(jié)果與糖尿病發(fā)病機(jī)制緊密相關(guān)。西瓜皮營養(yǎng)成分對Pathways in cancer信號通路作用靶點(diǎn)標(biāo)注圖（圖6）。

3 討論

糖尿病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前已經(jīng)明確的是與遺傳、糖代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、血小板活化致腎小球微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[26-29]。西瓜皮中含有豐富的營養(yǎng)成分，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，且其資源量大，藥用歷史悠久，而西瓜皮中所含的營養(yǎng)成分瓜氨酸具有提高免疫系統(tǒng)功能、維護(hù)關(guān)節(jié)運(yùn)動、平衡正常的血糖水平的作用，其多糖也表現(xiàn)出一定的降糖作用[9,16]。因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從細(xì)胞及分子水平系統(tǒng)全面的闡述其以何種生物途徑發(fā)揮防治糖尿病的作用機(jī)制顯得極為重要。

表3 西瓜皮防治糖尿病作用的GO生物學(xué)功能富集分析結(jié)果

續(xù)表3

表4 西瓜皮防治糖尿病作用的KEGG 通路富集分析結(jié)果

圖5 西瓜皮防治糖尿病作用的靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析部分結(jié)果圖

圖6 西瓜皮營養(yǎng)成分在糖尿病相關(guān)通路中的作用靶點(diǎn)標(biāo)注圖

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，將預(yù)測得到的22個目標(biāo)靶點(diǎn)導(dǎo)入KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，得到目標(biāo)靶點(diǎn)在Pathways in cancer 信號通路上的相關(guān)調(diào)控過程，結(jié)果顯示胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、表皮生長因子受體（pidermal growth factor receptor，IKKE）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,inducible，iNOS）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（p53 Cellular tumor antigen，p53）、雌激素受體（Estrogen receptor，ER）、腫瘤壞死因子受體超家族成員6（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，F(xiàn)AS）、轉(zhuǎn)錄因子E2F1（Transcription factor E2F1，E2F1）等靶點(diǎn)蛋白參與糖尿病的防治作用。Hai-Tao[30]等研究已證實(shí)人參皂苷Rg1 可降低糖尿病大鼠凋亡蛋白CASP3的表達(dá)，從而達(dá)到防治糖尿病的作用；于愛忠[31]等研究表明熊果酸能夠增加胰島素敏感性，抑制HIF-1α、核因子kappa-B激酶亞基β的抑制劑（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKKβ）、人核因子κB 抑制蛋白α（nuclear factor kappa B inhibitory protein alpha，IKBα）、核因子-k 基因結(jié)合（nuclear factor-k-gene binding，NF-kB）等炎癥因子的表達(dá)，而發(fā)揮預(yù)防糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變；王丹妮[32]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能降低糖尿病腎病大鼠腎組織中iNOS 與環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2 的表達(dá)水平，達(dá)到預(yù)防和保護(hù)腎臟的作用。張新爽[33]研究證實(shí)苯那普利能通過抑制Fas和Fas L的表達(dá)，達(dá)到防治糖尿病腎臟的損傷。雖然已有文獻(xiàn)證明這些目標(biāo)靶點(diǎn)具有防治糖尿病及并發(fā)癥的作用，但目前有關(guān)西瓜皮抗糖尿病作用機(jī)制的研究尚未涉及到這幾個靶點(diǎn)，因此，課題組下一步將深入研究這些目標(biāo)靶點(diǎn)如何發(fā)揮抗糖尿病的作用。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對西瓜皮活性營養(yǎng)成分防治糖尿病的作用進(jìn)行靶點(diǎn)和通路預(yù)測，篩選出西瓜皮8 個活性營養(yǎng)成分與疾病共同的直接作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖。通過通路富集分析，發(fā)現(xiàn)了31條通路和54個生物過程直接或間接參與防治糖尿病的作用。主要信號通路包括Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Chronic myeloid leukemia、Hepatitis B 等，主要生物過程包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、晝夜節(jié)律、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB 活性的負(fù)調(diào)控等，最終達(dá)到多成分、多靶點(diǎn)、多途徑防治糖尿病的生物學(xué)效應(yīng)。預(yù)測結(jié)果提示了西瓜皮活性營養(yǎng)成分防治糖尿病與Pathways in cancer 等信號通路密切相關(guān)，課題組下一步將擬選取這幾條通路進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，旨在為西瓜皮資源的開發(fā)利用及深入研究提供參考。