郭智勇，吳 攀，徐 偉，孟曉平

(西南石油大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，四川 成都 610500)

引言

近年來，隨著稀土納米材料的蓬勃發(fā)展，多種新型熒光材料隨之不斷出現(xiàn)，其中上轉(zhuǎn)換納米顆粒(up-conversion nanoparticles)以其獨(dú)特的光學(xué)性能，得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。上轉(zhuǎn)換納米熒光材料以無機(jī)物作為基質(zhì)，再向其中摻雜稀土離子得到[3-4]，由于其激發(fā)光頻率處于近紅外，頻率低而波長較長，從而它所獲得的熒光穿透度較深[5-7]。同時(shí)其熒光穩(wěn)定性好、毒性低、低熒光、檢驗(yàn)靈敏度高，所以在活體生物成像、生物探針、高通量單細(xì)胞檢測等前沿科學(xué)研究領(lǐng)域得到了大量的應(yīng)用[8-9]。該新型材料相對轉(zhuǎn)化效率要遠(yuǎn)低于其他普通材料，發(fā)光強(qiáng)度較低，雖然通過提高摻雜濃度可較大提高發(fā)光效率，但同時(shí)也極易產(chǎn)生熒光淬滅[10]。針對這一瓶頸問題，近年來許多研究人員進(jìn)行了深入的研究，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的發(fā)光效率得到了顯著提高。熒光壽命作為熒光信號的本征參數(shù)，不易受到激發(fā)光的強(qiáng)度、光漂白和熒光染漂的濃度等影響，僅與物質(zhì)所處的微環(huán)境參數(shù)有關(guān)，具有穩(wěn)定、不易受外界環(huán)境干擾的特點(diǎn)[11-13]。

目前測量熒光壽命的方法主要有：單光子測量(TCSPC)、相調(diào)制測量(phase modulation methods)和頻閃法測量(strobe techniques)[14-17]。相調(diào)制測量精度較差，不能廣泛地使用在各個(gè)場合；頻閃法測量分辨率較差，所含噪聲較多，不能精確測量；相對于以上兩種測量方法，TCSPC作為目前應(yīng)用最為廣泛的測量方法，雖然精度較高，但是基于其原理開發(fā)的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，高速測量效果較差，從而在一定程度上限制了科學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展[18-19]。

本文針對以上測量方式出現(xiàn)的問題提出了一種上轉(zhuǎn)化納米顆粒熒光壽命穩(wěn)定高速測量系統(tǒng)。本測量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，可對單分散狀態(tài)和聚集狀態(tài)下的上轉(zhuǎn)換熒光顆粒進(jìn)行單點(diǎn)或者持續(xù)測量，并在人機(jī)交互界面上顯示，測量系統(tǒng)穩(wěn)定，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

1 熒光壽命測量原理

1.1 熒光產(chǎn)生機(jī)理及壽命的定義

當(dāng)某種物質(zhì)被一束激光激發(fā)后，該物質(zhì)的分子吸收能量使處于基態(tài)(S0態(tài))的電子吸收一定波長的光子躍遷到某一激發(fā)態(tài)(S1中某一能級)，該過程時(shí)間極短(約10-15s)；處于該能級的電子通過輻射去活和非輻射去活的方式釋放能量，原理見圖1，前者伴隨著光子的放出，主要是發(fā)出熒光，也有一定的幾率發(fā)射磷光，后者主要通過碰撞等方式去活，主要途徑有內(nèi)轉(zhuǎn)化、熒光淬滅、系間跨越等途徑，沒有光子放出。去掉激發(fā)光后以輻射躍遷形式發(fā)出熒光回到基態(tài)，每個(gè)熒光分子的壽命長短不一，但所有熒光分子作為一個(gè)整體，其熒光強(qiáng)度I呈指數(shù)規(guī)律衰減，熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)的熒光最大強(qiáng)度的1/e倍所需要的時(shí)間稱為熒光壽命，常用τ表示[20-21]，如圖2所示。

圖1 熒光產(chǎn)生原理

圖2 熒光壽命定義

I=Imaxe-t/τ

(1)

式中:Imax是激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度；Imax/e是熒光壽命對應(yīng)的熒光強(qiáng)度；τ為熒光壽命。

1.2 測量原理

如圖3所示，在實(shí)驗(yàn)過程中，上轉(zhuǎn)換熒光納米材料顆粒在樣品池中流動(dòng)，在進(jìn)入光電倍增管對應(yīng)的測量位置處時(shí)，用短脈沖激光激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，該樣品發(fā)出熒光，通過熒光傳感器(光電倍增管)將熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號進(jìn)行采集。

圖3 流動(dòng)式聚集熒光分子

測量原理如圖4：

圖4 熒光壽命測量原理

該系統(tǒng)設(shè)計(jì)思路：首先通過激光激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒產(chǎn)生熒光，再由光電傳感器將熒光強(qiáng)度信號轉(zhuǎn)換成電信號并連接到數(shù)據(jù)采集卡，將其送入上位機(jī)中基于LabVIEW和MATLAB搭建的高速數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理、計(jì)算、顯示熒光壽命信號，以得到熒光壽命信息。

2 熒光壽命測量方案

本次研究以LabVIEW和MATLAB為核心工具對采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和計(jì)算，具體編寫過程如下。

2.1 LabVIEW程序設(shè)計(jì)

前面板顯示原始UCNPs熒光信號、UCNPs個(gè)數(shù)、UCNPs熒光壽命和平均壽命，可調(diào)節(jié)采樣率、采樣數(shù)和讀取數(shù)等參數(shù)，如圖5所示。

圖5 前面板設(shè)計(jì)

LabVIEW通用數(shù)據(jù)采集程序編寫連接：首先通過屬性助手節(jié)點(diǎn)(DAQNavi_Property_Assistant)選擇數(shù)據(jù)采集設(shè)備、通道和參數(shù)，再連接到創(chuàng)建節(jié)點(diǎn)(DAQNavi Create Channel)，創(chuàng)建一個(gè)通道并添加原始熒光信號數(shù)據(jù)；接著將數(shù)據(jù)送入定時(shí)節(jié)點(diǎn)(DAQNavi Timing-v001)，同時(shí)在前面板放置兩個(gè)數(shù)值輸入控件，分別命名為“采樣數(shù)”、“采樣率”；然后選擇讀取節(jié)點(diǎn)(DAQNavi Read)讀取指定通道(通道0)的數(shù)據(jù)，同時(shí)在前面板放置一個(gè)數(shù)值輸入控件和波形顯示控件；最后連接清理節(jié)點(diǎn)(DAQNavi Clear Task)，在使用完task之后，用DAQNavi ClearVI釋放VI，以避免重復(fù)分配內(nèi)存。節(jié)點(diǎn)連接如圖6所示。

圖6 框圖程序

2.2 MATALB編程

通過MATLAB編寫一串連續(xù)激發(fā)的上轉(zhuǎn)換納米熒光壽命信號，模擬并求解出熒光壽命。步驟如1～7。

1) 產(chǎn)生原始帶噪聲波形信號和濾波。真實(shí)熒光信號強(qiáng)度呈指數(shù)規(guī)律衰減，在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中采集到的熒光信號具有一定成分的干擾，因此用MATLAB生成指數(shù)類型噪聲波形，代碼：y1=(t-k*pi).*(t>=(k*pi)&t<(k+1)*pi)+0.5*rand(1, length(t)); y=1*0.2.∧(yn);這里設(shè)熒光信號的最大強(qiáng)度為1，干擾信號最大幅值為0.5。然后調(diào)用MATLAB移動(dòng)濾波函數(shù)語句smooth，并使用其線性最小二乘濾波方法(即lowess)將濾波點(diǎn)設(shè)置為8(選擇較大濾波點(diǎn)會讓濾波更平滑，且不會失真)。波形如圖7(a)、7(b)所示。

圖7 生成信號波形

2) 擬合去噪。觀察生成的濾波信號可發(fā)現(xiàn)該熒光信號在衰減的過程中有“突刺”，并非是平滑衰減為0，這是由于在激光對樣品進(jìn)行激發(fā)后產(chǎn)生了噪聲信號干擾，而這種干擾信號自始至終都是存在的，因此在這里采用最小二乘法數(shù)值擬合的方式對噪聲信號進(jìn)行“消除”。擬合去噪之后的熒光信號波形如圖8所示。

圖8 最小二乘法擬合熒光信號

3) 查找熒光信號極值點(diǎn)。 采用高等數(shù)學(xué)中極值處導(dǎo)數(shù)為零的定理來進(jìn)行程序的編寫：首先對整個(gè)波形求導(dǎo)(diff函數(shù))，由于波形是由采樣點(diǎn)構(gòu)成的，因此并不平滑，有時(shí)極值處并未為零。因此對求導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行求符號運(yùn)算(sign函數(shù))后再次求導(dǎo)。結(jié)果大于零處的點(diǎn)為極小值，小于零處的點(diǎn)為極大值。由于求導(dǎo)函數(shù)的計(jì)算方法使用后一個(gè)數(shù)據(jù)對前一個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行求導(dǎo)，因此數(shù)據(jù)點(diǎn)的橫坐標(biāo)須加1。代碼如下：

IndMin=find(diff(sign(diff(yy2)))>0)+1

IndMax=find(diff(sign(diff(yy2)))<0)+1

波形如圖9所示。

圖9 查找極值點(diǎn)“左對齊”熒光信號

4) “左對齊”熒光信號。 根據(jù)熒光壽命定義曲線可知，每一個(gè)熒光信號壽命均是從熒光強(qiáng)度極大值逐漸下降到極小值，而數(shù)據(jù)采集過程是實(shí)時(shí)的，那么進(jìn)入數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的熒光信號不能保證是一個(gè)完整的熒光信號(極大值開始，極小值結(jié)束)。對此，利用算法將進(jìn)入數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)的熒光信號首個(gè)極小值排除掉，在該極小值之前采集到的信號無論是否完整均不會進(jìn)入數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)首個(gè)進(jìn)入數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的熒光信號為“完整信號”。編程處理原理：判斷IndMax(1)與IndMin(1)的大小，若前者小于后者則滿足要求，否則IndMin 應(yīng)該重新取IndMin(2:end)。如圖9所示，進(jìn)入系統(tǒng)的首個(gè)極小值并沒進(jìn)入計(jì)算。

5) “右對齊”并計(jì)算熒光信號1/e點(diǎn)。 由前文知，熒光壽命是指熒光由強(qiáng)度最大衰減到最大強(qiáng)度的1/e倍所持續(xù)的時(shí)間。在計(jì)算之前，須判斷極大值與極小值是否“配對”。若length(IndMax2) 小于等于length(IndMin2)，則應(yīng)按照length(IndMax2)“右對齊”完成配對，得到1/e點(diǎn)處的熒光強(qiáng)度：lifetime_end =yy2(IndMax2)./exp(1)；若length( IndMax2) 大于length(IndMin2)則應(yīng)按length( IndMin2)來配對，同理lifetime_end =yy2(IndMax2(1:end-1))./exp(1)。

6) 查找1/e點(diǎn)對應(yīng)的索引計(jì)算熒光壽命lifetime。在極大值與極小值完成配對后，此時(shí)獲得的信號為完整的熒光壽命信號。在1/e點(diǎn)“左對齊”步驟中已經(jīng)得到在該點(diǎn)對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值，接著對1/e點(diǎn)處索引進(jìn)行計(jì)算。利用配對的極大值與極小值減去對應(yīng)的1/e點(diǎn)處的值，再取絕對值(函數(shù)abs)，此時(shí)1/e點(diǎn)形成新的函數(shù)極小值點(diǎn)，繼續(xù)使用min函數(shù)，得新函數(shù)的極小值點(diǎn)和對應(yīng)的索引minIdx，實(shí)現(xiàn)代碼：[xMin, minIdx]=min(abs(yy2(IndMax2(i:end-1):IndMin2(i))-lifetime_end(i)));進(jìn)而可以計(jì)算得到熒光壽命lifetime =minIdx*dis，結(jié)果如圖10所示。

圖10 計(jì)算配對熒光壽命

7) 計(jì)算熒光壽命個(gè)數(shù)與平均值。在計(jì)算完熒光壽命之后還需對熒光個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，熒光分子壽命個(gè)數(shù)為length(lifetime_end)，熒光分子壽命平均值為lifetime_Av=sum(lifetime)/length(lifetime)。

2.3 嵌入LabVIEW混合編程

將上述已經(jīng)由MATLAB成功進(jìn)行編程調(diào)試的程序嵌入LabVIEW中MATLAB script節(jié)點(diǎn)，連接函數(shù)節(jié)點(diǎn)，計(jì)算熒光壽命最大值、最小值、平均值，并且在前面板直接顯示出來。

3 軟件仿真結(jié)果分析與對比

對編寫的原始帶噪聲的虛擬熒光信號進(jìn)行濾波、擬合、查找極值、“左對齊”、求1/e點(diǎn)等操作之后，嵌入LabVIEW進(jìn)行計(jì)算處理。研究使用MATLAB編寫虛擬熒光信號幅值設(shè)為1，噪聲的幅值取0.5，生成1、3、5、50個(gè)連續(xù)熒光信號，采用的步長為0.05，即為采樣周期，熒光壽命等于步長乘以1/e點(diǎn)處索引與對應(yīng)的極大索引之差。仿真結(jié)果見圖11。

如圖11(a)、(d)、(g)、(j)所示原始熒光信號波形，系統(tǒng)顯示界面對熒光信號原始狀態(tài)能夠?qū)崟r(shí)無損顯示，隨著熒光分子數(shù)目增加，熒光分子信號波形不會發(fā)生畸變；對比擬合數(shù)據(jù)波形與原始熒光信號波形可知，擬合數(shù)據(jù)波形與原始信號波形形態(tài)基本一致，“去噪”干凈，呈指數(shù)規(guī)律衰減，但若噪聲更大，則需要進(jìn)一步改進(jìn)濾波方法；熒光壽命基本維持在1.40～1.95之間，波動(dòng)趨勢較穩(wěn)定；對比1、3、5、50個(gè)熒光信號濾波前后信號狀態(tài)，可發(fā)現(xiàn)該算法濾波效果較好，容錯(cuò)性較好，去噪效果明顯。

圖11 軟件仿真模擬結(jié)果

在對上面數(shù)量熒光信號進(jìn)行編程模擬輸出測量之后，繼續(xù)增加80、100兩組熒光分子數(shù)目，對熒光壽命的平均值、最大值、最小值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。

表1 熒光壽命統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)論

本次設(shè)計(jì)的熒光壽命測量系統(tǒng)以上轉(zhuǎn)換熒光顆粒(UCNPs)產(chǎn)生的熒光壽命檢測為應(yīng)用背景，基于MATALB和LabVIEW設(shè)計(jì)開發(fā)一套高速數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)，結(jié)合了軟件仿真與硬件模擬，實(shí)現(xiàn)了高速變量捕捉測量，對于熒光壽命測量設(shè)備的研發(fā)具有較大的實(shí)際指導(dǎo)意義。