魏小凡，謝作明，王 晶，高 班，孫家正，羅 艷

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.湖北省監(jiān)利環(huán)境保護(hù)局環(huán)境監(jiān)測(cè)站，湖北 監(jiān)利 433300)

高砷(As)地下水已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1]。砷的代謝微生物廣泛參與砷的生物地球化學(xué)循環(huán)[2]，在高砷地下水的形成中扮演著重要角色[3]。砷對(duì)微生物具有較強(qiáng)的毒性，砷酸鹽由于和磷酸鹽具有相似結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌表現(xiàn)出“磷酸鹽饑餓”癥狀，而對(duì)微生物產(chǎn)生毒性[4]。As(III)比As(V)毒性更強(qiáng)，可直接使蛋白酶失活[5]。由于長(zhǎng)期暴露在高砷環(huán)境中，微生物進(jìn)化出了耐砷基因，從而可以忍受高砷脅迫而適應(yīng)高砷環(huán)境[6]。Oremland等[3]揭示了基于細(xì)菌還原砷酸鹽或氧化亞砷酸鹽的DNA系統(tǒng)的進(jìn)化多樣性，隨著研究的深入，更多的砷代謝機(jī)制被發(fā)現(xiàn)[7]。

細(xì)菌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)附著在細(xì)菌表面或圍繞在細(xì)菌周圍，主要包含多糖和蛋白質(zhì)，還有少量核酸、腐殖質(zhì)和糖醛酸等物質(zhì)。細(xì)菌EPS是決定微生物表面性質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)[8]，在環(huán)境脅迫下，微生物會(huì)分泌更多的EPS[9]，而EPS圍繞在細(xì)胞表面形成屏障，避免金屬離子進(jìn)入微生物胞內(nèi)，以降低重金屬的毒害作用[10]。細(xì)菌EPS中含有很多帶負(fù)電荷的基團(tuán)如羥基、氨基、羧基和酰胺基等[11]，可以通過表面絡(luò)合、靜電吸附[8]和離子交換[12]等吸附環(huán)境中的Cu、Zn、Pb、As等金屬或類金屬。林青華等[13]研究認(rèn)為As(III)可以與細(xì)菌EPS中蛋白質(zhì)Ⅱ的多類位點(diǎn)結(jié)合，并且這個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)的放熱過程，同時(shí)細(xì)菌EPS可能也參與了砷的還原過程；Babechuk等[14]利用Shewanellasp.ANA-3研究時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌EPS上聚集有砷的還原產(chǎn)物。其他變價(jià)金屬Ag、U、Cr在細(xì)菌EPS的作用下也會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，如Marshall等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下ShewanellaoneidensisMR-1分泌的細(xì)菌EPS具有結(jié)合和還原U的能力；Vigneshwaran等[16]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌EPS中的蛋白質(zhì)能將Ag+還原成Ag納米顆粒；此外，Batool等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，在Cr(VI)的刺激下，微生物產(chǎn)生的細(xì)菌EPS包含一些Cr(VI)的還原酶，能將Cr(VI)還原為Cr(III)。

基于上述研究，本文以大同盆地高砷含水層沉積物中土著細(xì)菌D51001-1為生物材料，通過對(duì)該土著細(xì)菌進(jìn)行不同形態(tài)砷脅迫培養(yǎng)，分析了厭氧條件下土著細(xì)菌D51001-1受As(V)和As(III)脅迫時(shí)的生長(zhǎng)特征，以及細(xì)菌培養(yǎng)液中生物量、砷形態(tài)和細(xì)菌EPS組分的變化，并研究砷脅迫下土著細(xì)菌的防御機(jī)制和土著細(xì)菌對(duì)砷增強(qiáng)的響應(yīng)機(jī)制，為地下水中砷的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

試驗(yàn)所用土著細(xì)菌菌株為D51001-1(以下簡(jiǎn)稱細(xì)菌)，由中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院謝作明課題組從大同盆地高砷含水層沉積物中篩選得到。

據(jù)研究，山西大同盆地高砷地下水區(qū)屬于富有機(jī)質(zhì)還原水化學(xué)環(huán)境，pH值偏弱堿性，其變化范圍為7.5～8.6；無機(jī)砷以As(III)和As(V)兩種形態(tài)存在，并且主要以砷酸鹽為主，砷含量的變化范圍為0.6～1 820 μg/ L，部分地區(qū)超過2 000 μg/ L[18]。

1.2 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其配方為：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基模擬大同盆地高砷地下水環(huán)境，具體成分如下：KH2PO40.14 g/L，KCl 0.50 g/L，CaCl20.13 g/L，NaCl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.62 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，60%乳酸鈉5.4 mL/L，酵母提取物 1.00 g/L。少量酵母提取物提供微量元素，調(diào)節(jié)pH值至8.0左右，121℃高溫蒸汽滅菌30 min。

1.3 砷脅迫下土著細(xì)菌D51001-1的生長(zhǎng)

將土著細(xì)菌D51001-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，為消除有機(jī)培養(yǎng)基中有機(jī)質(zhì)對(duì)細(xì)菌ESP的影響，用0.9%NaCl溶液洗滌細(xì)菌使其重新懸浮于去離子水中制成細(xì)菌重懸液(OD600值為0.939)。

在兩組250 mL無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加As(V)和As(III)，最終濃度均為2 000 μg/L，設(shè)為試驗(yàn)組，另設(shè)一組不添加As作為對(duì)照組，其他條件與試驗(yàn)組保持一致，每組試驗(yàn)分別設(shè)3個(gè)平行。在厭氧操作箱中接種細(xì)菌重懸液，接種量均為2%；搖勻加蓋后用密封帶密封，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)；在厭氧培養(yǎng)箱中每隔24 h取樣一次，并用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD600值，并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

砷含量的測(cè)定采用原子熒光光度法(AFS-930，北京吉天儀器有限公司)[19]。菌液先經(jīng)0.22 μm濾膜過濾得上清液，上清液過離子交換柱分離得到As(III)和As(V)，因儀器檢測(cè)范圍限制，需對(duì)分離后的砷溶液進(jìn)行稀釋，保證其濃度低于50 μg/L；然后取1 mL含As(V)溶液，加入1 mL 50%鹽酸和2 mL硫抗(硫脲+抗壞血酸)預(yù)還原并定容至10 mL，并與等體積的As(III)溶液樣品一起上機(jī)檢測(cè)，儀器自動(dòng)測(cè)定砷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R值達(dá)到0.999以上；最后根據(jù)砷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋后的砷濃度，其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得上清液中As(V)和As(III)的濃度。

1.4 土著細(xì)菌D51001-1分泌EPS的提取和測(cè)定

試驗(yàn)采用改進(jìn)的EDTA法[20]提取細(xì)菌培養(yǎng)液中EPS。首先向菌懸液添加等體積2%的EDTA溶液，在25℃和300 r/min條件下?lián)u床振蕩提取3 h，再以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，上清液用0.22 μm 醋酸纖維素濾膜過濾，濾液即為細(xì)菌EPS粗提液；然后將細(xì)菌EPS粗提液用3 000 Da透析袋透析去除雜質(zhì)，室溫下用去離子水透析48 h，得到提純細(xì)菌EPS；最后將提純的細(xì)菌EPS定容，測(cè)定其中蛋白質(zhì)、多糖和核酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用Bradford法測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[21]；多糖采用苯酚-硫酸法測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[22]；核酸采用二苯胺比色法測(cè)定，以小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[23]。

1.5 土著細(xì)菌D51001-1細(xì)胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

分別取上述處理組和對(duì)照組細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，收集細(xì)菌細(xì)胞，真空冷凍干燥，得細(xì)菌細(xì)胞樣品，采用KBr壓片法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞樣品利用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析儀(Nicolet iS50，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行掃描分析，掃描波長(zhǎng)范圍為400～4 000 cm-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本次試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)主要用Excel和Origin 8.0軟件進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 砷脅迫下土著細(xì)菌D51001-1的生長(zhǎng)

光密度(OD)通常用作指示細(xì)菌的生長(zhǎng)[24]，圖1為不同砷形態(tài)下土著細(xì)菌D51001-1的生長(zhǎng)曲線。

圖1 不同砷形態(tài)下土著細(xì)菌D51001-1的生長(zhǎng)曲線

由圖1可見，細(xì)菌D51001-1在As(V)和As(III)的脅迫下均可以生長(zhǎng)，但是存在生長(zhǎng)差異；不同處理組下細(xì)菌均在第1 d達(dá)到最大生物量，隨后逐漸下降；細(xì)菌培養(yǎng)1 d后，As(V)處理組和對(duì)照組的OD600值分別為0.156和0.154，幾乎相同，而As(III)處理組的OD600值只有0.124，相比對(duì)照組降低了21%，說明細(xì)菌對(duì)As(V)脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，As(V)對(duì)生物體的毒性也低于As(III)[3]，因此前期細(xì)菌生長(zhǎng)幾乎不受影響；而As(III)由于抑制了細(xì)菌的生物合成途徑[25]，能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以溶液中細(xì)菌的生物量低；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，As(V)處理組的細(xì)菌生物量下降速率大于對(duì)照組，5 d后的OD600值比對(duì)照組降低了17%，可能是因?yàn)锳s(V)的毒性影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖。

2.2 土著細(xì)菌D51001-1對(duì)砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響

圖2為土著細(xì)菌D51001-1培養(yǎng)液中砷含量的變化。

圖2 土著細(xì)菌D51001-1培養(yǎng)液中砷含量的變化

由圖2可見，As(V)處理組溶液中As(V)含量由2 000 μg/L減少到794 μg/L，同時(shí)溶液中As(III)含量增加到1 058 μg/L，大量As(III)的產(chǎn)生表明土著細(xì)菌D51001-1具有還原As(V)的能力，這是由于耐砷菌株中的砷抗性系統(tǒng)，如磷酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[26]和ars操縱子[27]可以將細(xì)菌細(xì)胞中的砷排出胞外，從而減少砷富集對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的傷害[28]；每個(gè)As(V)和As(III)處理組溶液中所測(cè)得的總砷含量均低于初始總砷含量，表明有較小一部分砷被細(xì)菌吸附；在第1 d內(nèi)，As(V)處理組溶液中As(V)含量快速下降，而As(III)含量急劇增加，表明細(xì)菌對(duì)As(V)的還原效率最高，可能是因?yàn)榈? d內(nèi)細(xì)菌的活性最強(qiáng)，因而表現(xiàn)出最高的砷還原能力；隨著溶液中As(III)含量增加，砷的毒性增強(qiáng)，加之溶液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，細(xì)菌的活性減弱，細(xì)菌對(duì)As(V)的還原速度減緩；而As(III) 處理組幾乎未檢測(cè)出As(V)，說明該細(xì)菌對(duì)As(III)沒有氧化還原能力。

2.3 砷脅迫對(duì)土著細(xì)菌D51001-1分泌EPS的影響

細(xì)菌分泌的EPS含量采用蛋白、多糖和核酸含量的加和，圖3為As(V)和As(III)脅迫下土著細(xì)菌D51001-1的EPS分泌量。

圖3 As(V)和As(III)脅迫下土著細(xì)菌D51001-1的EPS分泌量

由圖3可見，各處理組和對(duì)照組的細(xì)菌EPS均在1 d內(nèi)快速積累，和細(xì)菌生長(zhǎng)保持一致；對(duì)照組中細(xì)菌EPS增加是細(xì)菌正常積累導(dǎo)致，到了后期細(xì)菌生物量有所下降，溶液中細(xì)菌EPS的積累速度變慢；不同處理組細(xì)菌分泌的EPS積累量差異顯著，表現(xiàn)為As(III)處理組>As(V)處理組>對(duì)照組。這是由于細(xì)菌對(duì)砷脅迫的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)菌的EPS分泌量增加，以減少有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的不良影響[9]，而細(xì)菌增加EPS分泌量的方式可能是其應(yīng)對(duì)砷脅迫的自我保護(hù)機(jī)制，所以在毒性更強(qiáng)的As(III)脅迫下，細(xì)菌增加EPS的分泌量。Saltikov等[29]也認(rèn)為細(xì)菌可以通過分泌EPS降低亞砷酸鹽對(duì)細(xì)菌群落的毒害作用?？梢姡林?xì)菌D51001-1可以還原As(V)到毒性更強(qiáng)的As(III)，是導(dǎo)致As(V)處理組中細(xì)菌EPS含量增加的另一個(gè)原因。

圖4為砷脅迫對(duì)土著細(xì)菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影響。

圖4 砷脅迫對(duì)土著細(xì)菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影響

由圖4(a)可見，培養(yǎng)期內(nèi)各試驗(yàn)組中細(xì)菌胞外蛋白的分泌量依次為As(III)處理組>As(V)處理組>對(duì)照組，表明細(xì)菌胞外蛋白的分泌隨砷毒性的增強(qiáng)而增多。這是由于蛋白中含有疏水性基團(tuán)[30]，蛋白含量的增加一方面可以增強(qiáng)細(xì)胞間的親和力，促進(jìn)細(xì)菌團(tuán)聚體的形成，從而避免溶液中砷對(duì)單個(gè)細(xì)胞的毒害；另一方面細(xì)菌細(xì)胞中的部分蛋白(如金屬硫蛋白類蛋白)對(duì)As、Cd、Hg等重金屬或類金屬有一定的抗性[31-32]，因此蛋白的增加可以增強(qiáng)細(xì)菌的抗砷能力。由圖4(b)可見，各試驗(yàn)組中細(xì)菌胞外多糖的分泌趨勢(shì)與胞外蛋白相同，即隨著砷毒性的增強(qiáng)，細(xì)菌分泌的胞外多糖含量逐漸增多。這是由于細(xì)菌可通過增加胞外多糖的分泌量加厚細(xì)胞外的胞外多糖層，抵御砷離子的脅迫，從而抵抗As(III)的侵害[33]。除蛋白和多糖的分泌以外，胞外環(huán)境中核酸含量的多少也可以指示細(xì)菌細(xì)胞的受損程度，核酸含量越高表明細(xì)菌細(xì)胞受損越嚴(yán)重。由圖4(c)可見，As(V)處理組中細(xì)菌的核酸含量比As(III)處理組低，說明As(III)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞受損更嚴(yán)重，不添加砷的溶液中檢測(cè)出的核酸含量增加是由于細(xì)胞的自然死亡導(dǎo)致的。圖4(d)反映了溶液中多糖與蛋白的含量比值(即多糖/蛋白)，對(duì)照組中蛋白與多糖含量相差較小，而處理組中蛋白含量明顯超過多糖含量，且As(III)處理組中細(xì)菌胞外多糖與蛋白含量的比值小于As(V)處理組。這是由于多糖與蛋白含量的比值反映了細(xì)菌表面正負(fù)電荷中和的結(jié)果[34]，隨著砷脅迫的增強(qiáng)，細(xì)菌分泌的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過多糖含量，導(dǎo)致細(xì)菌表面正電荷增強(qiáng)，從而減少對(duì)砷的吸附。

2.4 土著細(xì)菌D51001-1細(xì)胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

圖5為砷脅迫下土著細(xì)菌D51001-1細(xì)胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)譜圖。

圖5 砷脅迫下土著細(xì)菌D51001-1細(xì)胞的傅立葉紅外光譜(FTIR)譜圖

由圖5可以看出：

(2) 與對(duì)照組相比，經(jīng)過砷處理的細(xì)菌細(xì)胞譜圖中部分吸收峰發(fā)生了偏移，表明經(jīng)過砷脅迫后細(xì)胞表面的部分官能團(tuán)發(fā)生了相應(yīng)變化。其中，在3 433 cm-1位置的吸收峰偏移到3 431 cm-1和3 432 cm-1處，這說明As(V)和As(III)與—OH結(jié)合在一起；在1 637 cm-1位置的吸收峰偏移到了1 639 cm-1和1 638 cm-1處，表明酰胺基與As(V)和As(III)結(jié)合后發(fā)生的伸縮振動(dòng)變化；在900 cm-1位置的吸收峰偏移到了876 cm-1處，說明細(xì)菌表面物質(zhì)中的苯環(huán)被取代，可能是緊密結(jié)合在細(xì)菌表面的EPS吸附了As(III)所致。土著細(xì)菌D51001-1細(xì)胞FTIR譜圖中的吸收峰偏移和峰值強(qiáng)度變化證實(shí)了該細(xì)菌表面具有的官能團(tuán)對(duì)砷具有一定的吸附作用。

3 結(jié) 論

淺層高砷地下水環(huán)境中，土著細(xì)菌D51001-1通過在生理生化特性方面作出相應(yīng)調(diào)整以便適應(yīng)在砷脅迫環(huán)境中生存。本文通過室內(nèi)微宇宙模擬研究表明：淺層地下水系統(tǒng)中土著細(xì)菌D51001-1將As(V)還原為As(III)，增強(qiáng)了砷的毒性，為了應(yīng)對(duì)砷毒性增強(qiáng)而導(dǎo)致的環(huán)境脅迫加劇，土著細(xì)菌通過增加EPS的分泌，并提高細(xì)菌EPS中蛋白和多糖的比例，同時(shí)利用細(xì)菌表面具有的多種官能團(tuán)如羥基、羧基、酰胺基等增強(qiáng)對(duì)砷的結(jié)合能力，從而降低地下水環(huán)境中砷對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的傷害。因此，可以利用土著細(xì)菌這些特征性的變化來指示淺層地下水系統(tǒng)中的砷異常。