劉永錄， 李艷玲， 郭振環(huán)， 馬 霞*， 王 林， 張國(guó)祖

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院， 河南 鄭州 450011； 2. 河南省康星生物科技有限公司， 河南 焦作 454950； 3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司， 河南 鄭州451464)

超微粉碎技術(shù)是指利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法，將物料顆粒粉碎至微米級(jí)甚至納米級(jí)微粉的過(guò)程。中藥微粉碎利用機(jī)械或流體動(dòng)力將中藥材顆粒粉碎到粒徑為微米級(jí)或納米級(jí)，使中藥細(xì)胞破壁率達(dá)90%以上，可充分釋放細(xì)胞內(nèi)的有效成分，使其可直接接觸溶劑，從而提高藥材的生物利用度[1-2]，達(dá)到更好的用藥效果。但中藥材經(jīng)超微粉碎后，細(xì)胞壁被打破，中藥材的微觀特征已被徹底破壞，傳統(tǒng)的中藥材鑒別方法已不再適用，有必要找到一個(gè)更有效的方法來(lái)控制中藥微粉的質(zhì)量。

益母草是獸醫(yī)臨床上常用的中藥，在2012年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1773號(hào)中被列入《飼料原料目錄》，其具有活血調(diào)經(jīng)、安胎止痛等功效，可以用于母畜不孕、產(chǎn)后惡露不止等癥的治療[3-4]。為使益母草的功效發(fā)揮最大，將其制備成微粉。經(jīng)超微粉碎后可加速其有效成分的溶出速度，增強(qiáng)療效。但目前還沒(méi)有針對(duì)益母草微粉質(zhì)量研究的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，筆者對(duì)益母草微粉進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別，并使用激光粒度分析儀對(duì)其粒徑進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定益母草堿的含量并制定含量限度，以期為益母草微粉飼料原料的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品：10批300目益母草微粉樣品，河南省康星藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

儀器與試劑：LRVM-MHS-BE 型高頻震動(dòng)研磨機(jī)(山東龍脈科技發(fā)展有限公司)， Winner3003 型智能型激光粒度分析儀(濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司)，1100 型HPLC 儀(美國(guó)Agilent 公司)，AUW220D型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。鹽酸水蘇堿對(duì)照品(含量以99.6%計(jì)，批號(hào)110712-201111，中國(guó)生物制品檢定所)，鹽酸益母草堿對(duì)照品(含量以94.7%計(jì)，批號(hào)111823-201202，中國(guó)生物制品檢定所)，甲醇(上海試劑一廠)，乙腈(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 薄層鑒別

1) 對(duì)照品溶液的制備。取鹽酸水蘇堿對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，即為對(duì)照品溶液。

2) 供試品溶液的制備。精密稱取益母草微粉樣品1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，記錄重量，加熱回流2 h，放冷至室溫，再次稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾取濾液，即得。

3) 點(diǎn)樣和展開(kāi)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液10 μL，各點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-無(wú)水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，在105℃加熱15 min后放冷至室溫，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10∶1)混合溶液至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.2 益母草微粉粒徑的檢測(cè) 選用Winner3003干粉激光粒度儀，對(duì)10批益母草微粉樣品進(jìn)行粒徑分布檢測(cè)。取適量樣品置于激光粒度分析儀的樣品槽中，使樣品平鋪均勻。操作粒度分析儀上吸塵、送氣、進(jìn)樣，激光粒度分析儀自動(dòng)測(cè)量出粒徑分布及結(jié)果。

1) 儀器的精密度考察。取標(biāo)樣金剛砂重復(fù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)粒徑分布，統(tǒng)計(jì)D50(指50%的顆粒小于某個(gè)粒徑值)和D90的RSD，考察儀器精密度。

2) 水分的考察。取含水量分別為5.7%、6.3%、7.7%和8.6%的益母草微粉進(jìn)行粒徑分布檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)<48 μm和>75 μm粒徑分布情況。

3) 重復(fù)性考察。取同一批次益母草微粉重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定粒徑分布，統(tǒng)計(jì)<48 μm和>75 μm粒徑分布，計(jì)算RSD。

4) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批次益母草微粉分別在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h及24 h進(jìn)樣測(cè)定其粒徑分布。

5) 10批藥材樣品的粒度檢測(cè)。取10批藥材制備的益母草微粉，每批分別進(jìn)樣3次進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定<48 μm粒子所占的百分比限度和>75 μm粒子所占百分比限度[5]。

1.2.3 益母草堿含量的測(cè)定

1) 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm。理論板數(shù)按鹽酸益母草堿峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2) 對(duì)照品溶液的制備。精密稱定鹽酸益母草堿對(duì)照品5.68 mg，置于200 mL量瓶中，加70%乙醇溶劑并定容至刻度，制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

3) 供試品溶液的制備。精密稱取益母草微粉1 g，放入具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h后放冷至室溫，再稱量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取濾液，即得。

4) 專屬性考察。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，在前述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

5) 線性關(guān)系考察。分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μL、8 μL、10 μL、15 μL和20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，將所得到的峰面積與對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量進(jìn)行線性回歸。

6) 樣品的含量測(cè)定。分別對(duì)十批不同藥材來(lái)源制成的益母草微粉按照上述建立的方法處理，測(cè)定益母草微粉中益母草堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層鑒別

從圖1可知，在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置供試品均出現(xiàn)了相應(yīng)的紅色斑點(diǎn)，空白溶劑未出現(xiàn)干擾，表明，該方法能有效鑒別出益母草微粉中的鹽酸水蘇堿成分。

注：1，水蘇堿；2～4，益母草微粉樣品；5，空白溶劑對(duì)照

Note:1, stachydrine; 2-4,L.heterophyllusmicropowder samples; 5, blank solvent control

圖1益母草微粉薄層鑒別

Fig.1 TLC identification ofL.heterophyllusmicropowder

2.2 益母草微粉的粒徑

2.2.1 儀器的精密度 從表1可知，金剛砂的D50平均值為25.83 μm，在標(biāo)準(zhǔn)值(26±0.7)μm的范圍內(nèi)，且D50的RSD為0.69%。D90的平均值為37.50 μm，RSD為1.65%。表明，Winner3003干粉激光粒度儀的精密度良好。

表1 益母草微粉粒徑測(cè)定的精密度及重復(fù)性

Table 1 Precision and repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

μm

注：D50和D90的RSD分別為0.69%和1.65%。

Note:RSDs of D50and D90were respectively 0.69% and 1.65%.

2.2.2 水分 從表2可知，益母草微粉不同含水量(5.7%～8.6%)<48 μm的平均粒徑為98.35%，RSD為0.56%，差異不顯著。說(shuō)明水分在9.0%之下對(duì)粒徑檢測(cè)結(jié)果影響不大，但水分大于9.0%時(shí)，微粉易結(jié)塊、儀器易堵塞，對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。

表2 益母草微粉不同含水量樣品的粒徑分布比例

Table 2 Particle size distribution ratio ofL.heterophyllusmicropowder with different moisture content

%

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 從表3可知，<48 μm的粒徑分布平均為99.09%，RSD為0.31%。說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好，滿足粒徑測(cè)定要求。

表3 益母草微粉粒徑測(cè)定的重復(fù)性

Table 3 Repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

編號(hào)No.<48 μm粒徑分布<48 μm particle distribution>75 μm粒徑分布>75μm particle distribution199.550.03299.060.14399.030.12498.580.26599.110.12699.190.11平均 Mean99.090.13RSD0.31-

2.2.4 穩(wěn)定性 從表4可知，24 h內(nèi)<48 μm的粒徑分布平均值為98.37%，RSD為0.43%。表明供試品粒徑在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 益母草微粉粒徑測(cè)定的穩(wěn)定性

Table 4 Stability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

%

2.2.5 10批藥材樣品的粒經(jīng) 從表5可知，10批樣品的粒經(jīng)小于48 μm顆粒百分比為97.83%～99.63%，平均值為 98.61%，RSD為0.75%；大于75 μm顆粒百分比為0.05%～0.50%，平均值為0.26%。根據(jù)取整數(shù)原則，將益母草微粉粒徑的上限設(shè)定為小于48 μm顆粒百分比不低于95%，而上限定為大于75 μm顆粒百分比不超過(guò)1.0%較為適宜。

表5 10批益母草微粉的粒徑檢測(cè)結(jié)果

Table 5 Particle size distribntion ratio of 10 batches ofL.heterophyllusmicropowder %

批次Batch No.<48 μm顆粒的占比<48 μm proportion>75 μm顆粒的占比>75 μm proportion1607020199.530.051607020297.830.501607030197.880.451607030299.190.051607040197.920.491607040298.380.191607050199.630.061607050299.400.091607060198.050.431607060298.270.27平均 Mean98.610.26限度Limitation951

2.3 益母草堿的含量

2.3.1 專屬性 在供試品色譜中，對(duì)照品位置相同保留時(shí)間出現(xiàn)了益母草堿峰，說(shuō)明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系 經(jīng)測(cè)定，峰面積與對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量的線性回歸方程為y=1 482.8x-21.076，R= 0.999 6。表明鹽酸益母草堿進(jìn)樣量在0.15～0.60 μg時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 樣品的含量測(cè)定 從表6可知，10批益母草微粉的益母草堿含量變幅為0.073%～0.081%，平均值為0.077%。根據(jù)獸藥有效成分含量限度制定原則，選取10批不同藥材來(lái)源樣品均值的80%作為最低限度，即益母草堿的含量應(yīng)不低于0.06%，即益母草微粉含益母草堿不得少于0.60 mg/g。

表6 10批益母草微粉益母草堿的含量

Table 6 Content ofL.heterophyllusalkaloid in ten batches ofL.heterophyllusmicropowder

批號(hào)Batch No.含量/% Content批號(hào)Batch No.含量/% Content160702010.073160704020.081160702020.074160705010.078160703010.077160705020.077160703020.079160706010.075160704010.081160706020.075

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明，在薄層圖譜中，供試品在對(duì)照品斑點(diǎn)位置出現(xiàn)相應(yīng)斑點(diǎn)，且無(wú)干擾，可用于益母草微粉的鑒別；益母草微粉粒徑的上限為小于48 μm顆粒百分比不低于95%，下限為大于75 μm顆粒百分比不超過(guò)1.0%。HPLC檢測(cè)中，益母草堿的進(jìn)樣量為0.15～0.60 μg時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 6)；10批樣品的益母草堿含量變幅為0.073%～0.081%，平均為0.077%。建議控制益母草飼料原料中益母草微粉含益母草堿不少于0.60 mg/g。

含量測(cè)定方法首要參考了2015版《中華人民共和國(guó)獸藥典》[6]，采用高效液相色譜法分別從稱樣量、稀釋倍數(shù)和進(jìn)樣量等方面進(jìn)行優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法；可以認(rèn)為，益母草微粉中益母草堿含量不低于0.06%即為合格，所以益母草堿可作為其質(zhì)量控制的定量指標(biāo)。

粒徑檢測(cè)是區(qū)別于傳統(tǒng)散劑的一個(gè)重要手段。微粉的粒度檢查采用激光衍射法，參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部粒度和粒度分布測(cè)定法第3法(光散射法)[7]，選用的檢測(cè)儀器為Winner 3003干粉激光粒度儀。干法檢測(cè)適用于一切粉體顆粒，不受顆粒物理、化學(xué)性質(zhì)的限制，不僅適用于在液體中發(fā)生形狀變化、發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或損失其成分的顆粒，還適用于磁性顆粒。藥典上規(guī)定的細(xì)粉、最細(xì)粉和極細(xì)粉均標(biāo)明通過(guò)相應(yīng)目數(shù)篩網(wǎng)的比例不少于95%。益母草微粉的粒度為300目(48 μm)，因此將粒徑標(biāo)準(zhǔn)定為小于48 μm的粒子不少于95%。200目對(duì)應(yīng)的粒徑大小為75 μm，因此將大于75 μm的粒子作為粒徑的上限。