張懷 陳明權(quán) 農(nóng)根林 何風(fēng)雷 覃仁安

[摘要] 目的 建立新會陳皮質(zhì)量控制方法。 方法 高效液相色譜法（HPLC）色譜條件為Atlantis T3-C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.5%醋酸水系統(tǒng)，以流速1.0 mL/min進(jìn)行梯度洗脫。檢測波長為283 nm和330 nm，測定46批次不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間、不同陳化時(shí)間新會陳皮的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素含量。計(jì)算比值范圍，并對陳化年份和3種化合物含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。 結(jié)果 橙皮苷含量≥2.56%，川陳皮素含量≥0.27%，橘皮素含量≥0.18%，3種黃酮類化合物含量的比值范圍為100∶（7.58～22.09）∶（4.89～14.55）。陳化年份和橙皮苷、川陳皮素之間沒有相關(guān)性，陳化年份和橘皮素呈負(fù)相關(guān)（r = -0.345，P < 0.05）;橙皮苷、川陳皮素、橘皮素三者含量之間存在正相關(guān)性（r = 0.544、0.581、0.873，均P < 0.01）。 結(jié)論 這3種化合物的限量標(biāo)準(zhǔn)及比值范圍能有效地控制新會陳皮的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 新會陳皮;質(zhì)量控制;橙皮苷;川陳皮素;橘皮素

[中圖分類號] R284.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0120-05

Quality control research of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium

ZHANG Huai? ?CHEN Mingquan? ?NONG Genlin? ?HE Fenglei? ?QIN Ren′an

Guangzhou Baiyunshan Chenliji Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangdong Province， Guangzhou? ?510288， China

[Abstract] Objective To establish the quality control method of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium. Methods The chromatographic conditions of high performance liquid chromatography （HPLC） were Atlantis T3-C18 column （4.6 mm × 250.0 mm， 5 μm）， and mobile phase was acetonitrile-0.5% acetic acid water system， gradient elution was at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 283 nm and 330 nm. The contents of hesperidin， nobiletin and tangeretin in 46 batches of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium with different origins， different harvesting time and different aging time were detected. The ratio range was calculated. Pearson correlation analysis was performed on the aged years and the contents of the three compounds. Results The hesperidin content was not less than 2.56%， the nobiletin content was not less than 0.27%， and the tangeretin content was not less than 0.18%， and the ratio range of the three flavonoids was 100∶（7.58-22.09）∶（4.89-14.55）. There was no correlation between the aging of aging and hesperidin or nobiletin. The age of aging was negatively correlated with hesperidin （r = -0.345， P < 0.05）; there was a positive correlation among hesperidin， nobiletin and tangeretin （r = 0.544， 0.581， 0.873， all P < 0.01）. Conclusion The limited standards and ratio ranges of these three compounds could control the quality of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium effectively.

[Key words] Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium; Quality control; Hesperidin; Nobiletin; Tangeretin

陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium）為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥狀[1]。藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”[2]，廣陳皮是茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi的干燥成熟果皮，主要產(chǎn)于廣東新會，以新會陳皮為道地藥材。陳皮中含有黃酮[3-5]、多糖[6-8]、揮發(fā)油[9-11]等，其黃酮類成分有2個(gè)類型：一類是黃酮苷類成分，如橙皮苷、柚皮苷等;另一類是多氧甲基黃酮類，主要有川陳皮素、橘皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮等[12-15]。現(xiàn)代藥理作用和臨床研究表明，陳皮黃酮有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生理作用[16-19]。《中華人民共和國藥典》（2015版，以下簡稱《中國藥典》）中以橙皮苷含量不得少于3.5%作為陳皮質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究及文獻(xiàn)資料中發(fā)現(xiàn)，部分新會陳皮橙皮苷含量達(dá)不到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但質(zhì)量優(yōu)于其他產(chǎn)地陳皮，然而只測定橙皮苷含量無法全面反映新會陳皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究選取黃酮類成分中含量較多的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素作為指標(biāo)，對46批不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間、不同陳化年份的新會陳皮藥材進(jìn)行測定。初步制訂3種指標(biāo)性成分的含量范圍及比例范圍，并對其陳化年份和3種化合物含量之間進(jìn)行相關(guān)性分析，為新會陳皮質(zhì)量控制的研究提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜議;Atlantis T3-C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）;DAD檢測器;Millpore simplicity-67120型超純水器;BS110S型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）;WXJ型粉碎機(jī)（上海凱旋中藥機(jī)械制造有限公司）;KQ-100DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品橙皮苷（中國食品藥品檢定研究院，純度96.1%，110721-201617）;對照品川陳皮素（成都萊寶科技有限公司，純度98%，AF7122105）;橘皮素（成都萊寶科技有限公司，純度98%，AF8012603）;各批次陳皮由廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司農(nóng)根林藥師鑒定為茶枝柑的干燥成熟果皮;乙腈色譜純（Fisher公司）;甲醇和冰乙酸分析純（廣州化學(xué)試劑廠）;水為超純水;其他試劑均為分析純。46批新會陳皮樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Atlantis T3-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流速1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長283 nm（0～30 min），330 nm（30～60 min）;梯度洗脫條件見表2?；旌蠈φ掌罚ˋ）和供試品（B）溶液高效液相色譜法（HPLC）色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備

取陳皮樣品粉末0.50 g（過80目篩），精密稱定。置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量。超聲提取30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足失重。靜置后取上清液過0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取橙皮苷、川陳皮素、橘皮素適量對照品，加甲醇溶解。配成每1 mL含橙皮苷0.1537 mg、川陳皮素0.0520 mg、橘皮素0.0364 mg的混合對照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，以各成分峰面積Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。分別得到橙皮苷（283 nm）[Y = 28.995X + 0.08（r = 0.9998）]、川陳皮素（330 nm）[Y = 34.5X + 0.1467（r = 0.9999）]、橘皮素（330 nm）[Y = 44.258X + 0.09（r = 0.9999）]。線性范圍分別為0.1537～3.0740 μg、0.0520～1.0400 μg和0.0364～0.7280 μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同1份混合對照品混合溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。橙皮苷為1.20%，川陳皮素為0.94%，橘皮素為0.85%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同1份供試品溶液10 μL，分別在0、3、6、12、24、48 h按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積積分值，計(jì)算RSD值。橙皮苷為1.52%，川陳皮素為1.09%，橘皮素為1.43%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同1供試樣品6份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，測得峰面積積分值。分別代入“2.4”項(xiàng)回歸方程，計(jì)算含量和RSD值。結(jié)果橙皮苷、川產(chǎn)皮素、橘皮素的RSD值分別為1.72%、1.65%、1.34%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取同1批已知3種化合物含量的廣陳皮樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分成三組。分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150%，3個(gè)水平加入混合對照品，按供“2.2”項(xiàng)試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析。測定橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的含量，計(jì)算回收率和RSD值。見表3。

2.9 樣品測定

取不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間、不同貯藏年份新會陳皮樣品，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，測得峰面積積分值。代入“2.4”項(xiàng)回歸方程，分別計(jì)算3種化合物的含量，并計(jì)算三者比例。見表4。

2.10 相關(guān)性分析

利用SPSS 19.0對46批次新會陳皮樣品的陳化年份和橙皮苷、川陳皮素、橘皮素3種化合物含量之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果見表5。陳化年份和橙皮苷、川陳皮素沒有相關(guān)性，陳化年份和橘皮素呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）;橙皮苷、川陳皮素、橘皮素三者含量之間存在正相關(guān)性（均P < 0.01）。

3 討論

根據(jù)表4中數(shù)據(jù)可以得出新會陳皮橙皮苷≥2.56%，川陳皮素≥0.27%，橘皮素≥0.18%，3種化合物含量的比例在100：（7.58～22.09）：（4.89～14.55）。參考鐘永翠等[20]根據(jù)不同品種陳皮中3種黃酮類成分的含量比值，可以鑒別廣陳皮道地性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)表5中，3種化合物之間具有顯著的正相關(guān)性，該比例范圍具有初步鑒定新會陳皮的作用。但是該范圍是否能適用所有新會陳皮，還需要更多的新會陳皮和其他產(chǎn)地陳皮的研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)于陳化年份與橙皮苷、川陳皮素、橘皮素3種化合物含量之間的相關(guān)性弱的問題，通過本實(shí)驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)分析[21-23]，發(fā)現(xiàn)陳皮中這3種黃酮類化合物性質(zhì)較穩(wěn)定，陳化年份和陳化方式等因素對其含量的影響不大;不同批次樣品的含量差異主要是由采收期不同產(chǎn)生的，3種化合物的含量變化均與成熟度呈一定規(guī)律：越成熟，含量越低。即青皮的含量最高，微紅皮次之，大紅皮含量最低。

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)等系統(tǒng)。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最后采用乙腈-0.5%乙酸水溶液，梯度洗脫，各化合物都能取得良好的分離度，無拖尾。吸收波長在30 min處由283 nm變?yōu)?30 nm，各化合物都在最大吸收波長處采集峰面積，計(jì)算含量，減少誤差。

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