李詩言 崔益瑋 王 揚 戴志遠 沈 清 *

（1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012

2浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心 杭州 310023

3浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012）

微囊藻毒素（Microcystins）為藍藻水華釋放的一類具有強烈致癌作用的肝毒素，其毒性較大，分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體約80余種，其結(jié)構(gòu)由7個氨基酸組成，主要產(chǎn)自微囊藻（Microcystis aeruginosa）、魚腥藻（Anabaena）、念珠藻（Notoc）等浮游性藍藻，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中MC-LR最為常見[1]。調(diào)查表明，我國60%的水體由于過多接納了氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)，使水體的生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了重大變化，導(dǎo)致藻類的異常繁殖生長，從而出現(xiàn)藍藻水華現(xiàn)象[2]。水面湖靛堆積，大量消耗水中溶解氧致魚類窒息死亡，藻體死亡分解過程中釋放生物毒素類次級代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致水體污染，水生動植物死亡[3]。MC進入人體肝細胞后，能強烈地抑制蛋白磷酸酶（PP1、PP2A）的活性，誘發(fā)細胞角蛋白高度磷酸化，導(dǎo)致肝細胞微絲分解、破裂和出血[4]。

食品中的微囊藻毒素的分析監(jiān)測對于維護食品安全和人類健康具有重要意義。微囊藻毒素被列為有機污染毒素的監(jiān)測項目，并有國家標準推薦的水體中微囊藻毒素的安全質(zhì)量濃度為1 μg/L。目前主要化學(xué)分析法包括薄層色譜（TLC）[5]、氣相色譜（GC）[6]、液相色譜（LC）[7]、毛細管電泳（CE）[8]等。其中高效液相色譜法（HPLC）是目前應(yīng)用最多的方法，利用液相色譜的特點，與質(zhì)譜或核磁共振聯(lián)用確定其分子式和結(jié)構(gòu)[9]。該方法分析速度快，靈敏度高，結(jié)構(gòu)準確穩(wěn)定。該方法只針對目標化合物，對于潛在的異構(gòu)體無法檢測。

本試驗針對微囊藻毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有共同母核的結(jié)構(gòu)特征，創(chuàng)新性地采用PreIS的掃描方式，建立DIA檢測法，經(jīng)質(zhì)譜分析并優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，以提高離子化效率，降低雜質(zhì)干擾。通過比較LC-MS/MS和DIA兩種方法的線性、精密度、靈敏度、回收率、經(jīng)濟性等參數(shù)，建立穩(wěn)定、高效的微囊藻毒素分析方法，用于快速分析水體及動植物中的殘留，確定監(jiān)測物種、采樣站位和頻率、警戒值和防控反應(yīng)機制等，為相關(guān)部門完善和強化水產(chǎn)品監(jiān)測和管理工作提供科學(xué)依據(jù)，從而保障食用安全和近岸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent公司；4000QTrap串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，美國Ab Sciex公司，配有Harvard Pump11恒流注射泵、電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Sanorius BS110S分析天平，北京賽多利斯公司；MDF-382E超低溫冰箱，日本Sanyo公司；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 主要材料與試劑

微囊藻毒素 MC-RR，YR，LR，LA，LF，LY 及LW標準品（純度＞95.0%）：臺灣 Algal Science公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1；Oasis HLB固相萃取柱，美國Waters公司；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和甲酸（FA），德國Merck公司，色譜純；純凈水，由Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純；螺螄購買自杭州物美超市，新鮮度佳。

準確稱取微囊藻毒素標準品各0.01 g，用甲醇溶解于10 mL棕色容量瓶并定容，分別配置成1.0 mg/mL的儲備液至于4～6℃冷藏備用。

1.3 樣品處理

將10 g螺螄肌肉組織研磨均質(zhì)，取1 g置于5 mL離心管，加入5 mL萃取液（MeOH/water/FA，90/9.9/0.1，V/V）后振蕩混勻20 min，并用探頭式超聲（25 kHz，60%變幅）提取 10 min。完畢后混合物用冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）以8 000 r/min離心15 min。用移液槍轉(zhuǎn)移離心管中上清液到另一個新的移液管，并繼續(xù)向沉淀中加入5 mL萃取液并重復(fù)上述操作提取兩次。將3次提取的上清液合并，用氮氣吹干，并用甲醇水溶液復(fù)溶至約1 mL。

Oasis HLB固相萃取柱分別用6 mL甲醇和水活化。萃取液均勻上柱，并依次用6 mL純水和淋洗液（MeOH/water，5/95，V/V）淋洗，棄去淋洗液，以5 mL純甲醇洗脫吸附在HLB柱上的微囊藻毒素，流速控制在1滴/s左右，收集洗脫液。將洗脫液用氮氣流吹干，使用初始流動相復(fù)溶至1 mL后過0.22 μm有機濾膜，濾液待儀器分析。

1.4 試驗條件

1.4.1 LC-MS/MS條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫：ini，25%B；0～1 min，25%B；1～5 min，25%～95%B；5～9 min，95%B；9～10，95%～25%B；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)離子檢測模式（MRM），噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度450℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氮氣，氣簾氣30 psi，GS1 為 35 psi，GS2 為 55 psi。

1.4.2 直接進樣條件 注射泵進樣流速20 μL/min；質(zhì)量掃描范圍m/z 400～600。電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，PreIS 離子檢測模式，特征碎片離子為m/z 135.2，噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度550℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氮氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 微囊藻毒素離子化特征分析

微囊藻毒素的離子化特征是影響分析結(jié)果的重要因素之一。試驗首先通過注射進樣1 ng/mL的各微囊藻毒素標準品進行Q1全掃描。微囊藻毒素在正離子模式的離子化效率顯著優(yōu)于負離子模式，各個標準品的雙電荷和單電荷離子峰均有檢出，如質(zhì)子化、鈉離子化、鉀離子化及組合離子化（[M+H+Na]2+）等。鑒于實際樣品檢測過程中復(fù)雜基質(zhì)干擾易造成雙電荷和單電荷離子峰強度比例波動，進而影響定量結(jié)果，需優(yōu)化檢測條件，盡可能使微囊藻毒素離子結(jié)構(gòu)單一化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)向溶劑中添加0.1%的甲酸可顯著提高微囊藻毒素雙電荷離子強度，抑制單電荷離子強度（圖2）。因此，本試驗7種微囊藻毒素均采用[M+2H]2+為MRM模式的母離子。該試驗結(jié)果與部分報道有所不同，Beltrán檢測了6種微囊藻毒素發(fā)現(xiàn)除了MC-RR易形成雙電荷[M+2H]2+外，其余均檢測為[M+H]+[10]；王超等[11]建立了反復(fù)凍融-固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定藍藻中5種微囊藻毒素的方法，選用MC-RR、MC-YR和MC-LR的[M+2H]2+為母離子，其余為[M+H]+。本試驗進一步通過安捷倫6540 QToF離子化驗證，初步認定不同廠家的質(zhì)譜儀均會對微囊藻毒素離子化行為造成顯著影響。由于微囊藻毒素離子化行為的特殊性，建議針對不同質(zhì)譜儀建立相應(yīng)標準化檢測方法。

圖1 微囊藻毒素骨架結(jié)構(gòu)圖與微囊藻毒素R1和R2位置官能團結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The chemical structures of microcystin backbone and the groups of R1and R2

2.2 直接進樣條件優(yōu)化

直接進樣法是一種基于三重四極桿質(zhì)譜儀，利用特征官能團，通過離子源內(nèi)分離實現(xiàn)對不同樣品中目標化合物快速掃描的方法。該方法主要利用母離子掃描模式，選定目標化合物經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的共有母核，同步檢測對應(yīng)母離子及含相同母核的同系物。目前直接進樣法應(yīng)用于磷酸化多肽[12]、天然產(chǎn)物[13]、脂質(zhì)組學(xué)[14-15]等研究。本試驗通過注射進樣1 ng/mL的各微囊藻毒素標準品進行子離子掃描檢測，微囊藻毒素裂解產(chǎn)生的碎片較多，典型碎片包括m/z 213.2、m/z 163.0、m/z135.2、m/z 105.2、m/z 103.1 等（表1），其中 m/z 135.2為微囊藻毒素的共有基團Adda的甲氧鍵斷裂形成的特征碎片峰，該峰豐度最強，故設(shè)定m/z135.2為特征子離子掃描含有該母核的目標化合物。由于母離子掃描模式下無法針對各個微囊藻毒素單獨設(shè)置DP和CE，通過折衷優(yōu)化選定DP 60 eV和CE 55 eV。直接進樣法母離子掃描模式下7種微囊藻毒素質(zhì)譜圖見圖3，各微囊藻毒素的離子峰較為純凈，均主要以[M+2H]2+為主，鈉離子化和鉀離子化峰不明顯。

2.3 LC-MS/MS條件優(yōu)化

向流動相A、B中分別加入0.1%的甲酸，使微囊藻毒素的液相環(huán)境與針泵優(yōu)化時條件一致，最大化雙電荷離子化微囊藻毒素質(zhì)譜峰豐度。采用流動注射的方式優(yōu)化得到最佳質(zhì)譜參數(shù)噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度 450℃，源內(nèi)氣簾氣 30 psi，GS1為35 psi，GS2為55 psi，并對不同微囊藻毒素優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE）結(jié)果見表1。

圖2 甲酸酸化微囊藻毒素全掃描模式下質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of microcystins under Q1 full scan with formic acid

圖3 直接進樣法母離子掃描模式下檢測7種微囊藻毒素Fig.3 PreIS of seven microcystins by direct injection method

表1 微囊藻毒素質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of mass spectrometry for microcystins

使用梯度洗脫7種微囊藻毒素并在10 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，峰型尖銳、對稱（圖4），出峰順序為 MC-RR、YR、LR、LA、LY、LW 及 LF，對應(yīng)的保留時間分別 為 6.52，6.93，7.01，8.20，8.25，8.74及9.01 min。含精氨酸（R）片段的微囊藻毒素（MC-RR、YR和LR）極性較強，尤其MC-RR含有兩個精氨酸片段，故首先出峰，MC-LW和LF的保留時間較長，主要由于其側(cè)鏈苯環(huán)增加了與C18固定相之間的疏水作用，進而提高了其在色譜柱上的保留能力。

2.4 方法比較

逐級稀釋標準混合工作液分別進行LC-MS/MS和DIA檢測，測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計軟件分析計算標準曲線線性，以S/N=3所對應(yīng)的被測化合物的含量作方法的檢出限（LOD），以S/N=10所對應(yīng)的被測化合物的含量作方法的定量下限（LOQ）；于空白螺螄樣品中分別加入10 μg/L含量的微囊藻毒素標樣，每組做6個平行樣品，分析并測定精密度及回收率，試驗結(jié)果見表2。使用LC-MS/MS建立的微囊藻毒素標準曲線線性（0.9965～0.9993）優(yōu)于DIA標準曲線（0.9907～0.9968）。由于微囊藻毒素在針泵進樣時樣品未經(jīng)預(yù)分離直接源內(nèi)離子化，離子化競爭較為激烈，導(dǎo)致單個微囊藻毒素離子化效率降低，而LC-MS/MS中混合樣品經(jīng)色譜預(yù)分離，源內(nèi)單個微囊藻毒素較為純凈，因此DIA的LOD和LOQ均高于LC-MS/MS。LC-MS/MS微囊藻毒素回收率范圍在73.9%～83.4%（RSD 3.6%～6.1%），而DIA的回收率在69.3%～84.2%（7.6%～9.8%）。相比之下，DIA分析時間較短，同時檢測7種微囊藻毒素僅需1 min即可完成，而LC-MS/MS需要10 min才能檢測完成。除此之外，DIA無需液相色譜柱和流動相溶劑，可大大縮減耗材成本、減輕環(huán)境負擔。

圖4 多反應(yīng)監(jiān)測模式下7種微囊藻毒素的提取離子流圖Fig.4 The extracted ion chromatography of seven microcystins under MRM mode

2.5 實際樣品分析

螺螄樣品采自本地農(nóng)貿(mào)市場，兩種檢測方法均從60個隨機樣品中檢出陽性樣品38個。結(jié)果顯示主要微囊藻毒素污染種類為MC-RR和LR，MC-YR、LA、LF、LY 及 LW 均未檢出；以螺螄為代表的淡水生物微囊藻毒素污染較為嚴重，陽性率達到了63.3%，間接反映河道水體富營養(yǎng)化污染，藻類大量繁殖，釋放毒素并通過食物鏈生物富集對人類健康造成威脅。

3 結(jié)論

本試驗分別采用了LC-MS/MS和DIA對7種微囊藻毒素進行了分析檢測。LC-MS/MS是目前最為廣泛使用的化合物定量方法，通過甲酸酸化溶劑抑制單電荷離子強度，選用雙電荷離子為MRM定量定性母離子大大提高了方法穩(wěn)定性。DIA為新型快速檢測技術(shù)，選定碎片m/z 135.2可快速篩查所有含有該母核的微囊藻毒素，該方法目前尚未見國內(nèi)外文獻報道。通過比較發(fā)現(xiàn)兩種方法在精確度、靈敏度、回收率、耗時等方面各有優(yōu)缺點。根據(jù)研究結(jié)果建議當待測樣品數(shù)量較多時，首先采用DIA進行初次篩選，對于陽性樣品利用LC-MS/MS進行二次檢測。該分析測試策略可有效減少檢測時間、色譜柱損耗及溶劑消耗，提高效率、降低成本；同時陽性樣品先后經(jīng)DIA和LC-MS/MS檢測相當于對結(jié)果進行了二次驗證，提高了結(jié)果的可靠性。

表2 微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和直接進樣法效率比較Table 2 The performance comparison of LC-MS/MS and direct injection methods for the analysis of microcystins