仝令君 潘明慧 艾娜絲 孫寶國

（北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048）

牛乳，作為一種高營養(yǎng)食品，適合于各種年齡段的人群，而且因其含有大量人類生命活動所需的營養(yǎng)素，被人們稱之為“白色血液”[1]。有關(guān)牛乳成分和結(jié)構(gòu)的組成及生物學(xué)功能尚不完全清楚，尤其是牛乳脂質(zhì)復(fù)雜的組成成分以及它們特殊的結(jié)構(gòu)組織需進(jìn)一步分析。

牛乳脂肪是以脂肪球的形式存在的，乳脂肪球是乳腺上皮細(xì)胞分泌的天然膠體[2]，由甘油三酯及包裹在外面的3層膜結(jié)構(gòu)（Mill Fat Global Membrane，MFGM）組成。MFGM是由多種生物活性分子組成的，如：極性脂、蛋白質(zhì)、糖蛋白、膽固醇、酶及其它微量組分，其中磷脂與蛋白質(zhì)占MFGM干重的90%以上[2-4]。目前，國內(nèi)外許多研究集中于MFGM的組成及功能特性，而對于牛乳在加工過程中其磷脂的破壞、損失程度以及MFGM中磷脂域的變化鮮有報(bào)道。大量文獻(xiàn)報(bào)道，MFGM具有的乳化能力在一定程度上取決于MFGM雙分子層上的表面活性物質(zhì)-蛋白質(zhì)及磷脂[5-7]。牛乳在加工后，MFGM磷脂的變化對牛乳的乳化性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而可能改變牛乳品質(zhì)。本文主要對MFGM磷脂在牛乳加工過程中發(fā)生的變化及磷脂域的動力學(xué)研究進(jìn)行綜述，為牛乳加工工藝的優(yōu)化提供科學(xué)參考。

1 MFGM中脂質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)

牛乳脂肪球較簡單的乳滴更為復(fù)雜，主要是因?yàn)橹厩虮簧锬ぃ∕FGM；厚度：10～15nm）所包裹，而MFGM的結(jié)構(gòu)和組成取決于牛乳分泌機(jī)制。MFGM主要由極性脂質(zhì)組成，如甘油磷脂和鞘脂類、膽固醇、蛋白質(zhì)、糖蛋白和酶[8-9]。Keenan等[10]研究指出MFGM上脂質(zhì)的主要組成成分，如表1所示：MFGM上的極性脂質(zhì)主要被分為5類：磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC；19.2%～37.3%）、磷 脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidylethanolamine，PE；19.8%～42%）、 鞘磷脂（sphingomyelin，SM；18%～34.1%）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI；0.6%～13.6%）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS；1.9%～16%），其中PC和SM主要位于細(xì)胞膜外層，PE、PI和PS均集中在磷脂雙分子層內(nèi)部[11-16]。Fong等[8]還在牛乳MFGM上發(fā)現(xiàn)了少量乳糖基-腦苷脂和葡糖基-腦苷脂。此外，牛乳甘油磷脂中富 含 低 熔 點(diǎn) 不 飽和脂 肪 酸（C18：1，C18：2，C18：3），在MFGM的流動性中起重要作用；以鞘氨醇堿為主要特征的鞘磷脂（主要為SM），富含高熔點(diǎn)的長鏈飽和脂肪酸（C16：0，C22：0，C23：0，C24：0）[8，12]，這些組成可能是牛乳風(fēng)味組成的重要前體物質(zhì)。

表1 牛乳脂肪球膜上脂質(zhì)構(gòu)成組分及百分含量[10]Table 1 Contents and percentage of lipids in milk fat globule membrane[10]

MFGM作為三層膜結(jié)構(gòu)組織是被廣泛接受的，內(nèi)層膜源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，外層磷脂雙分子層來自乳腺上皮細(xì)胞頂端質(zhì)膜[17]。由于MFGM磷脂雙分子層來源于分泌細(xì)胞的頂端質(zhì)膜，因此雙分子層的流動鑲嵌模型被廣泛認(rèn)可。如圖1所示，此模型表明：磷脂雙分子層作為MFGM的骨架，以流動相的形式存在，外周膜蛋白質(zhì)不均勻的鑲嵌或松散附著于雙分子層上，跨膜蛋白質(zhì)貫穿整個磷脂雙分子層[18-19]。MFGM雙分子層的流動性特征間接引起牛乳中MFGM組分及結(jié)構(gòu)受許多因素影響，如牛乳加工（主要是均質(zhì)、熱處理），環(huán)境因素，動物飲食及自身因素等[13]。

圖1 Singer和Nicolson（1972）提出的磷脂雙分子層的流動鑲嵌模型Fig.1 Schematic of the fluid mosaic membrane according to Singer and Nicolson（1972）

2 磷脂變化對乳制品品質(zhì)的影響

近年來，牛乳乳化性及穩(wěn)定性備受關(guān)注[20-21]，而MFGM在牛乳乳化特性方面扮演著至關(guān)重要的角色[22]。磷脂是膜的整體部分，既具有親油性，又具有親水性，因此有助于脂肪球膜的乳化作用[23]。Shimizu等[24]證實(shí)了磷脂、糖脂和蛋白質(zhì)成分共同影響MFGM乳化作用，并利用木瓜蛋白酶去除糖蛋白或通過磷脂酶C破壞磷脂結(jié)構(gòu)，從而使奶油乳液穩(wěn)定性顯著降低。Thomé和Eriksson等[25]研究表明，當(dāng)添加MFGM膜材料時(shí)，巴氏消毒和無菌奶油的攪拌能力得到提高，當(dāng)磷脂與蛋白質(zhì)復(fù)合時(shí)，磷脂對乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于乳化劑和乳液穩(wěn)定劑。因此，磷脂的破壞可能導(dǎo)致MFGM的損壞，從而導(dǎo)致乳制品品質(zhì)降低。例如：奶油中脂肪球聚集形成漂浮在熱茶或咖啡表面上的可見斑點(diǎn)是由磷脂酶C降解MFGM磷脂引起的[26]。磷脂酶作用可以增加膜的滲透性，而不會引起脂肪球的聚集，這就使脂肪酶和其它酶降解甘油三酯，增加了乳制品酸敗以及其它異味的產(chǎn)生。MFGM磷脂也在牛乳氧化以及氧化所引起的風(fēng)味缺陷中起著重要的作用；MFGM中的磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺含有40%～60%的多不飽和脂肪酸，其中約三分之一易于氧化[27]。因此，分離得到的乳脂肪球膜在儲存期間發(fā)生氧化不足為奇[28]。O'Mahony和Shipe[29]通過磷脂酶C對乳脂蛋白作用從而抑制氧化味道的產(chǎn)生，證實(shí)磷脂在氧化中存在的意義，并將此抑制作用歸因于磷脂水解得到的甘油二酯遷移至脂肪球的疏水核心中，從而抑制甘油二酯的氧化。

磷脂的變化是多樣性的。乳腺分泌過程以及后續(xù)的加工處理都會對MFGM的結(jié)構(gòu)和組成造成一定的影響，如：攪拌、溫度、牛乳中細(xì)菌數(shù)量、乳腺炎、哺乳期及季節(jié)等；這些乳腺分泌過程和后續(xù)加工處理可能會影響MFGM組分缺失、MFGM對乳清組分的吸附能力以及MFGM中各組分的物理化學(xué)反應(yīng)等，從而可能影響乳品的乳化特性[30]。Bhojoo等[31]指出：在低溫條件下（<7℃），脂肪球具有較高比例的固體脂質(zhì)，從而大大提高了脂肪球的抗剪切力，在一定程度上提高了牛乳的穩(wěn)定性。Evers等[30]也發(fā)現(xiàn)溫度除影響脂質(zhì)的液固比，也可能影響MFGM組分（主要是磷脂）的結(jié)晶作用。Corredig和Dalgleish等[6]研究表明，從原料乳或原料稀奶油中提取的MFGM可穩(wěn)定大豆水包油乳化劑，主要是由于MFGM覆蓋在水包油乳化劑的表面，不可被表面活性劑取代，從而在水包油乳化劑的表面界面處可能存在MFGM之間的強(qiáng)相互作用，且MFGM的磷脂成分可能參與降低界面張力。原料乳MFGM大豆水包油乳化劑的乳化性能優(yōu)于成品酪乳MFGM大豆水包油乳化劑[5]，這可能是由于在生產(chǎn)酪乳過程中熱處理或攪拌工藝促使MFGM蛋白與β-乳球蛋白相結(jié)合所導(dǎo)致的。此外，Patton等[32]指出：離心新鮮牛乳制備的脫脂乳中磷脂成分較老化的UHT乳制備脫脂乳中的磷脂組成少，可能是由于UHT乳穩(wěn)定性更好，間接表明磷脂成分的變化可能會影響牛乳的穩(wěn)定性。綜上所述，乳品加工過程中，加工工藝的變化或多或少會引起MFGM磷脂的變化，而磷脂在乳品品質(zhì)方面也起著不可或缺的作用，截至目前，對乳品的乳化活性起重要作用的是MFGM的磷脂還是蛋白質(zhì)，或者兩者皆起作用仍尚未清楚；且MFGM磷脂及蛋白質(zhì)的變化如何影響乳品品質(zhì)也未研究透徹，這為后續(xù)研究提供新的視角。

3 乳品加工工藝對MFGM磷脂的影響

3.1 不同加工乳制品中磷脂組分的差異

原料乳中約60%磷脂位于MFGM中，但在制備脫脂乳時(shí)，離心分離會導(dǎo)致MFGM表面磷脂的損失，從而影響脫脂乳的品質(zhì)[33-34]，且本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，脫脂鮮乳的感官喜好性顯著（P＜0.05）低于全脂鮮乳，這也可能與離心制備脫脂乳時(shí)MFGM表面的磷脂損失有關(guān)[35]。此外，其它文獻(xiàn)也報(bào)道了牛乳加工處理會改變MFGM的結(jié)構(gòu)與組成，具體研究結(jié)果如表2所示[36]。

表2 原料乳，生奶油，商業(yè)乳和脫脂乳粉的磷脂（占磷脂總質(zhì)量的百分比）組成[36]Table 2 Phospholipid composition（weight%of total phospholipids）of raw milk，raw cream，commercial milk and buttermilk powder[36]

3.2 乳制品加工時(shí)MFGM磷脂域動態(tài)變化

3.2.1 磷脂域及其組成 磷脂域即由膽固醇、飽和磷脂和不飽和磷脂組成的二元體系，也稱液態(tài)流動相。Veatch和Keller[37]通過對此二元體系的研究來確定MFGM上磷脂域的相圖，如圖2所示，此相圖顯示了兩個不同流動相共存的區(qū)域，相位的共存取決于特定壓力、脂質(zhì)濃度及溫度等條件。目前，人們普遍認(rèn)為共存相中的某些區(qū)域中分子是有序排列的，稱之為液態(tài)有序相（Liquid ordered phase，Lo）；其它區(qū)域中磷脂分子的排列是無規(guī)則的，稱之為液態(tài)無序相（Liquid disordered phase，Ld或 Lα）。Lopez等[2]指出，MFGM 的 Lo相富含高相變溫度的極性脂（主要是SM，其含量占MFGM極性脂的25%，此外也含有飽和的磷脂及膽固醇）。而Ld相主要由不飽和的甘油磷脂組成（PC、PE、PI和PS）[38-39]。當(dāng)兩相共存時(shí)，它們被分成兩個不同的區(qū)域，兩相中的有序度主要取決于磷脂中脂肪酸的取向。

圖2 含有磷脂和膽固醇二元基質(zhì)的雙層膜相圖[37]Fig.2 Phase diagrams for bilayer membranes containing binary mixtures of phospholipids and cholesterol[37]

3.2.2 磷脂域微觀結(jié)構(gòu)的研究技術(shù) 迄今為止，許多研究采用不同的顯微鏡技術(shù)來分析MFGM的結(jié)構(gòu)，例如：電子顯微鏡學(xué)和免疫顯微技術(shù)[40]、生物化學(xué)技術(shù)[41]、冷凍蝕刻電鏡技術(shù)[42]以及冷凍復(fù)型-免疫化學(xué)染色技術(shù)[43]。但由于這些技術(shù)在分析觀察MFGM微觀結(jié)構(gòu)試驗(yàn)中，耗時(shí)太長，可能會改變MFGM的結(jié)構(gòu)或者觀察期間引入了其它雜質(zhì)而對試驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響[43]。最近，許多研究者使用激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy，CLSM）并結(jié)合熒光染料標(biāo)記磷脂相的技術(shù)來闡明脂質(zhì)筏（磷脂域）的存在，觀察MFGM上富含膽固醇及磷脂的區(qū)域。此外，CLSM技術(shù)可通過對巨型單層囊泡的表面進(jìn)行成像來分析脂質(zhì)雙分子層系統(tǒng)中磷脂的橫向結(jié)構(gòu)[44-46]，且此技術(shù)中使用的低濃度外源熒光探針和染料已被證明不會引起MFGM天然生物結(jié)構(gòu)的顯著改變[47]。Evers[48]通過采用CLSM作為非侵入式技術(shù)結(jié)合親脂性探針和凝集素研究牛乳及母乳的MFGM結(jié)構(gòu)。

通常而言，針對MFGM結(jié)構(gòu)研究所采用的熒光探針包括 Rh-DOPE、WGA-488、Nile Red和Fast Green FCF等。其中，Rh-DOPE是極性磷脂探針，它可以進(jìn)入MFGM雙分子層而不對磷脂雙分子層產(chǎn)生較大干擾，且具有較好的耐光性，在采用CLSM對MFGM磷脂進(jìn)行熒光標(biāo)記觀察結(jié)構(gòu)時(shí)更易捕捉到圖像[36]。由于Lo相富含的脂肪酸鏈中C=C鄰位交叉更為完整，使有序相變得更加緊湊[49]，因此Rh-DOPE可以順利地進(jìn)入Ld相使其產(chǎn)生紅色熒光，而不能進(jìn)入磷脂排列整齊的Lo相，而使 Lo相區(qū)域發(fā)暗，如圖3a所示[50]，Lopez等[51]也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，并提出磷脂域的圖解模型，如圖3b所示。

圖3 室溫（19℃±1℃）下脂肪球膜上極性脂分布圖像[50]（a）和MFGM上磷脂域的圖解模型[51]（b）Fig.3 Microscopy images captured at room temperature（19℃±1℃）showing the distribution of polar lipids within milk fat globule membrane[50]（a）and graphic model of phospholipids domains on MFGM[51]（b）

3.2.3 磷脂域動態(tài)變化在乳品工業(yè)中，控溫技術(shù)在保障牛乳質(zhì)量以及改變?nèi)橹破返墓δ芴匦苑矫姘l(fā)揮著重要的作用[52-53]。目前，Lopez 等[50，54]對不同溫度及時(shí)間條件下MFGM磷脂域的動力學(xué)進(jìn)行了分析，如圖4所示，Lopez指出極性脂質(zhì)在MFGM的外層中分離成可共存的且具有不同物理性質(zhì)的兩個或多個流動相（例如凝膠，Lo和Ld相）；溫度及溫度變化速率影響磷脂域的數(shù)量、大小和形狀，快速冷卻有利于成核機(jī)制，緩慢冷卻有利于結(jié)晶域的生長。Et-Thakafy等[54]也指出牛奶的快速冷卻可以加速脂肪球的成核速率，且在同一溫度下隨著放置時(shí)間的增加將誘導(dǎo)MFGM中磷脂的重組，從而導(dǎo)致磷脂域成圓形；當(dāng)溫度從4℃升到60℃的過程中，MFGM上磷脂域發(fā)生相變，即由液態(tài)有序相轉(zhuǎn)變成液態(tài)無序相，使得MFGM磷脂間分子結(jié)合較為松散。這些由溫度和時(shí)間動力學(xué)引起的磷脂域形態(tài)和物理性質(zhì)的變化可能會影響乳脂肪球（如黃油生產(chǎn)）的功能特性及其營養(yǎng)功能，從而對乳制品品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。

圖4 不同溫度及時(shí)間處理后MFGM上磷脂域的變化[54]Fig.4 Changes of phospholipids on MFGM after different temperature and time[54]

4 結(jié)語及展望

乳脂肪球膜是具有特定組成、結(jié)構(gòu)和界面特性的獨(dú)特膠體組合物，且含有大量具有特異性的生物活性成分，例如：脂肪酸、MFGM蛋白和MFGM極性脂質(zhì)中大量的SM。至今，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)MFGM的相關(guān)信息，其中大部分都是關(guān)于乳脂肪球膜蛋白的研究，而對于MFGM磷脂及磷脂域動力學(xué)的研究相對較少。磷脂是膜的整體部分，磷脂的變化更易引起MFGM結(jié)構(gòu)及組分的改變，進(jìn)而影響乳品品質(zhì)。乳品加工方式復(fù)雜多樣，包括攪拌、濃縮、加熱和噴霧干燥，所有的加工工藝都可能導(dǎo)致MFGM磷脂含量及相的改變，引起磷脂變化的多樣性。

目前，對于乳品加工過程中引起的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、組分及含量的變化對乳制品品質(zhì)的影響機(jī)制可能需從以下幾方面做進(jìn)一步的研究，牛乳中乳脂肪球的大小與分布如何發(fā)揮其在乳品品質(zhì)中的作用；MFGM中富含鞘磷脂的Lo相作為移動平臺是否具有改變?nèi)橄嘟缑鎻埩Φ墓δ埽桓缓柿字遗帕幸?guī)則的Lo相與富含不飽和磷脂、呈無序排列的Ld相在理化特性上是否相同；MFGM中橫向磷脂以及它的異質(zhì)性在乳品加工中會有怎樣的變化以及此種變化是否會影響乳制品的穩(wěn)定性、流變性和乳化性等理化性質(zhì)。