鐘英英，謝勇鵬，郭莎莎，魏小月，壽瑾，葉云

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

辣木（Moringa oleifera Lam．）為辣木科、辣木屬植物，起源于印度北部的亞喜馬拉雅山地帶。近年來(lái)，辣木在我國(guó)廣東、云南、海南等都有引種栽培。2012 年辣木葉被中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)為新資源食品。目前國(guó)內(nèi)外的研究證明辣木葉提取物具有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用[1]。

胰脂肪酶主要來(lái)源于胰腺腺泡細(xì)胞，當(dāng)人體進(jìn)食后，食物中的脂肪會(huì)被胰脂肪酶水解成小分子，被人體吸收后再次重新合成人體脂肪。因此，抑制體內(nèi)胰脂肪酶活性可有效地抑制體內(nèi)脂肪的吸收和水解，減少脂肪的沉積，達(dá)到預(yù)防與治療肥胖的目的[2]。植物來(lái)源的天然化合物具有安全性高、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，從植物中篩選新的、副作用更小的胰脂肪酶抑制劑一直是研究熱點(diǎn)[3-5]。本研究主要分析不同條件下辣木籽浸提物對(duì)胰脂肪酶活力影響的變化趨勢(shì)，通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)分析考察其對(duì)胰脂肪酶抑制類(lèi)型，為綜合利用辣木葉提供了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣木葉：產(chǎn)于湖南省月山城，除雜后粉碎，過(guò)80 目篩，密封陰暗處保存?zhèn)溆?；胰脂肪酶? 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；苯、乙醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、吡啶、醋酸銅（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 不同因素所得提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

1.2.1.1 不同乙醇濃度所得提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

精密稱(chēng)取辣木葉粉5 份，每份1.000 g，分別加入40%、50%、60%、70%、80% 乙醇 40 mL，在超聲功率為 400 W，料液比為 1 ∶40（g/mL）,提取 500 s。所得提取液進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，分別測(cè)定其抑制率。

1.2.1.2 不同提取時(shí)間所得提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

精密稱(chēng)取辣木葉粉7 份，每份1.000 g，提取時(shí)間為200、300、400、500、600、700、800 s，超聲功率為 400 W，料液比為 1 ∶40（g/mL），50 ℃，加入 50%乙醇 40 mL 進(jìn)行提取。所得提取液進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，分別測(cè)定其抑制率。

1.2.1.3 不同超聲功率所的提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

精密稱(chēng)取辣木葉粉5 份，每份1.000 g，于超聲功率為 100、200、300、400、500 W，料液比為 1 ∶40（g/mL），50 ℃，50%乙醇40 mL 提取500 s。所得提取液進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，分別測(cè)定其抑制率。

1.2.1.4 不同液料比所得提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

精密稱(chēng)取辣木葉粉 5 份，每份 1.000 g，按照 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）的料液比，加入 50%乙醇，在超聲功率400 W，50 ℃，提取500 s。所得提取液進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，分別測(cè)定其抑制率。

1.2.1.5 不同提取溫度所得提取物對(duì)脂肪酶活性的影響

精密稱(chēng)取辣木葉粉5 份，每份1.000 g，在溫度為 40、50、60、70、80 ℃，加入 50 % 乙醇，在料液比為1 ∶40（g/mL），，超聲功率 400 W，提取 500 s。所得提取液進(jìn)行抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，分別測(cè)定其抑制率。

1.2.2 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響提取較大的3個(gè)因素，以胰脂肪酶活力的抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，確定最佳提取條件。

1.2.3 胰脂肪酶活力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[6-7]的方法，略作修改。KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH 7.4）3 mL 和橄欖油 1 mL，37 ℃預(yù)熱10 min 后加入2 mL 酶液，攪拌10 min 后加入8 mL苯，繼續(xù)攪拌2 min 后終止反應(yīng)，萃取生成脂肪酸。離心10 min，取4 mL 有機(jī)相，加入顯色劑（5%醋酸銅溶液pH 6.1）1 mL，攪拌3 min，使產(chǎn)生的脂肪酸與Cu2+充分反應(yīng)生成綠色絡(luò)合物。離心10 min，取上層溶液，710 nm 處測(cè)吸光度。同法制備不含脂肪酶溶液作為參比。

胰脂肪酶的酶活計(jì)算公式如下：

式中：X 表示胰脂肪酶的酶活力，U/mL；c 為脂肪酸濃度，μmol/mL；V 為脂肪酸溶液體積，mL；V′為胰脂肪酶的用量，mL；t 為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.4 辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制

以空白管為空白溶液進(jìn)行調(diào)零，辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為不加樣品時(shí)吸光值；A2為加入提取物時(shí)的吸光值；A3為加入提取物但未加酶和底物的吸光值。

1.2.5 辣木葉提取物抑制類(lèi)型的研究

在15 mL 反應(yīng)體系中加入2 mL 10 mol/mL 的胰脂肪酶酶液，在底物添加量分別為0.5 mL 和1 mL 測(cè)定不同辣木葉提取物濃度（1、5、10、25、50 mg/mL）胰脂肪酶酶解脂肪的反應(yīng)速度,以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，辣木葉提取物濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)作Dixon 圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度乙醇提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響

不同濃度乙醇提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響見(jiàn)圖1。

從圖1 可以看出，乙醇濃度在40%～70%范圍內(nèi)，抑制率隨乙醇濃度增大呈上升趨勢(shì)，乙醇濃度為70%時(shí)，抑制率達(dá)到最大。乙醇濃度超過(guò)70%后，抑制率隨乙醇濃度增大呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)檩^低濃度的乙醇溶液不能完全把辣木葉中的有效成分提取出來(lái)，而過(guò)高濃度的乙醇溶液又會(huì)造成提取物中溶于乙醇[8]，導(dǎo)致抑制率下降。

圖1 不同濃度乙醇提取物對(duì)胰脂肪酶活性的影響Fig.1 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different ethanol concentration

2.2 不同提取時(shí)間所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性的影響

不同提取時(shí)間所得提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取時(shí)間所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different time

從圖2 可以看出，在300 s～400 s 范圍內(nèi)，抑制率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)；在400 s～600 s范圍內(nèi)，抑制率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升；提取時(shí)間為600 s 時(shí)，抑制率達(dá)到最大值。超過(guò)600 s 抑制率則隨提取時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降?？赡苁且?yàn)闀r(shí)間小于400 s時(shí)，辣木葉中的有效成分未被完全提出，而400 s～600 s時(shí)，辣木葉提取物與胰脂肪酶的作用趨于飽和狀態(tài)，600 s 時(shí)辣木葉總有效成分基本被完全提??；再延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取出的有效成分被氧化分解或部分有效成分在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下高溫降解，使得抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[9]。故選取最適提取時(shí)間為600 s，最適提取時(shí)間范圍為400 s～600 s。

2.3 不同超聲功率所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響

不同超聲功率所得提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同超聲功率所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響Fig.3 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different ultrasonic power

從圖3 可看出，功率在100 W～300 W 時(shí)，抑制率隨超聲功率增大呈明顯上升趨勢(shì)。在300 W 時(shí)，抑制率達(dá)到最大值；在300 W～500 W 范圍內(nèi)，抑制率隨超聲功率增大呈明顯下降趨勢(shì)。可能是因?yàn)槌暪β试?00 W～300 W 范圍內(nèi)時(shí)，隨超聲功率增大，溫度逐漸升高，提取出的有效成分增多，使得辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制增強(qiáng)。功率為300 W 時(shí)，辣木葉有效成分可能被完全提?。怀^(guò)300 W 會(huì)導(dǎo)致溫度過(guò)高，有效成分中的熱敏性物質(zhì)被氧化分解或長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下高溫降解[6]，使得抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故選取最適超聲功率為300 W。

2.4 不同料液比對(duì)胰脂肪酶活性的抑制

不同料液比所得提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同料液比所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響Fig.4 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different solid-liquid ratio

從圖4 可看出，料液比在 1 ∶30（g/mL）～1 ∶50（g/mL）范圍時(shí)，抑制率隨溶劑體積增大明顯上升。料液比為1 ∶50（g/mL）時(shí)抑制率達(dá)到最大；溶劑體積超過(guò) 50 倍時(shí)，抑制率隨溶劑體積增大呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榱弦罕仍?1 ∶30（g/mL）～1 ∶50（g/mL）范圍時(shí)，溶劑體積越大，提取物有效成分被提取出來(lái)越多，抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)溶劑體積超過(guò)50 倍時(shí)，隨溶劑體積增大，導(dǎo)致冷凝回流不夠充分，提取濃度變大，抑制反應(yīng)進(jìn)行并在料液比為1 ∶60（g/mL）時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)。故選取最適提取料液比為 1 ∶50（g/mL）。

2.5 不同提取溫度所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響

不同提取溫度所得提取物對(duì)脂肪胰酶活性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同提取溫度所得提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響Fig.5 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different tempreature

從圖5 可看出，提取溫度在40 ℃～60 ℃范圍內(nèi)，抑制率隨提取溫度升高呈上升趨勢(shì)；提取溫度為60 ℃時(shí)，抑制率達(dá)到最大；在60 ℃～80 ℃范圍內(nèi)，抑制率隨提取溫度升高呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)樘崛囟仍?0 ℃～60 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，辣木葉提取速率增加，提取效果提高，抑制率也逐漸上升；提取溫度在60 ℃時(shí)，提取效果最佳；提取溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，隨提取溫度升高，乙醇揮發(fā)和提取物中熱敏性物質(zhì)可能被破壞，導(dǎo)致提取效率變低，提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制率下降。故選取最適提取溫度為60 ℃，最適提取溫度范圍為 60 ℃～70 ℃。

2.6 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超聲功率對(duì)提取物抑制作用影響不明顯，故排除對(duì)超聲功率的考察，且固定超聲功率為400 W。故選取提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響正交表Table 1 The result of the orthogonal experiments for Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity

續(xù)表1 辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制影響正交表Continue table 1 The result of the orthogonal experiments for Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity

由表2 可知，各因素對(duì)胰脂肪酶活力抑制的影響順序依次為：乙醇濃度=提取時(shí)間>提取溫度>料液比，且最優(yōu)的組合為C2B3A1D3，即提溫度50 ℃、提取時(shí)間500 s、乙醇濃度 70%、料液比 1 ∶50（g/mL）。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，抑制率分別為80.36%、78.67%和78.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.06%，試驗(yàn)具有可行性。

2.7 抑制常數(shù)及抑制類(lèi)型的確定

含辣木葉提取物的胰脂肪酶反應(yīng)Dixon 圖見(jiàn)圖6。

圖6 含辣木葉提取物的胰脂肪酶反應(yīng)Dixon 圖Fig.6 Dixon curves of the reaction of pancreatic lipase in the presence of Moringa oleifera leaves extracts

Ki 為抑制常數(shù)，即酶-抑制劑復(fù)合物的離解常數(shù)。Ki 越小，抑制作用越強(qiáng)。由圖6 可知，改變提取物濃度，不同底物添加量對(duì)反應(yīng)速度的影響曲線(xiàn)交點(diǎn)橫坐標(biāo)的絕對(duì)值為10.71，即辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki=10.71 mg/mL，表明辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用較強(qiáng)。

辣木葉提取物胰脂肪酶反應(yīng)Lineweaver-Burk 圖如圖7 所示。

圖7 加辣木葉提取物后胰脂肪酶的Lineweaver-Burk 圖Fig.7 Lineweaver-Burk curves of the reaction of pancreatic lipase in the presence of Moringa oleifera leaves extracts

底物濃度倒數(shù)與反應(yīng)速度倒數(shù)曲線(xiàn)相交于橫軸，符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征[9]。說(shuō)明辣木葉提取物與酶活性中心以外的其他必需基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合不影響胰脂肪酶與底物的結(jié)合。胰脂肪酶與底物的結(jié)合，也不影響胰脂肪酶與辣木葉提取物的結(jié)合[10-11]。而且胰脂肪酶-底物-辣木葉提取物的復(fù)合物也不能進(jìn)一步變成產(chǎn)物。這種類(lèi)型抑制劑的抑制程度則僅取決于辣木葉提取物的濃度，即底物的濃度不會(huì)影響辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制程度。

3 結(jié)論

1）經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)，得出辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性的最佳抑制條件為：提取時(shí)間為500 s、提取溫度為 50 ℃、乙醇濃度為 70%、料液比為 1 ∶50（g/mL）及超聲功率為300 W 時(shí)，辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制效果最佳，為79.15%。

2）結(jié)合辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性反應(yīng)的Dixon 和Lineweaver-Burk 圖可知，辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制作用是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki=10.71 mg/mL。表明辣木葉提取物對(duì)胰脂肪酶活性抑制作用較強(qiáng)，抑制程度僅取決于辣木葉提取物的濃度。