李燕，郭興峰，張華，王玥科，劉嘉康

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252059）

金線草（Rubia membranacea）是茜草科茜草屬下的一個植物種，作為傳統(tǒng)中草藥，可治療疼痛、活血散瘀，祛風(fēng)除濕[1]。其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物、植物甾醇類、香豆素、脂類等[2]，其中最豐富的是黃酮類化合物，如3-O-β-D-吡喃半乳糖苷-鼠李黃素、3-O-β-D-吡喃半乳糖苷-槲皮素和木犀草素[3]。

黃酮類化合物（flavonoid），別名生物類黃酮，廣泛存在于自然界中，約1/4 的植物中含有黃酮。黃酮類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、降血脂、去病強(qiáng)身、改善血液循環(huán)、抗凝血、降低心腦血管疾病，延年益壽及抑制腫瘤發(fā)生、增殖和遷移的功效[4-6]，同時黃酮對金葡萄球菌、甲乙型鏈球菌、流感桿菌等具有很強(qiáng)的殺滅能力，能治療感冒、上呼吸道感染、急慢性氣管炎、支氣管炎、肺炎等疾病，因此黃酮類化合物對防治疾病以及人的健康有積極意義[7]。因黃酮易溶于有機(jī)溶劑，本試驗(yàn)選取乙醇回流提取法提取金線草中的黃酮，分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比4 個因素對提取效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計對金線草黃酮提取工藝進(jìn)行處理，得到金線草黃酮提取的最適宜工藝條件。本研究為金線草黃酮開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)，為更好地利用金線草資源奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金線草：湖南溪江；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；石油醚（AR）、丙酮（AR）、無水乙醇（AR）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA2004）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī)（QE-200）：武義縣屹立工具有限公司；紫外分光光度計（UV-1800）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；水浴鍋（SB-2000）：上海愛朗儀器有限公司；低速離心機(jī)（TD5）：長沙英泰儀器有限公司；恒溫?fù)u床（TS-100B）：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金線草黃酮提取工藝流程

金線草→粉碎→按照一定比例加入石油醚→抽濾→取濾渣→乙醇溶液回流提取→抽濾→定容→測定提取液中黃酮吸光度

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品37.5 mg置于100 mL 燒杯中，溶于60%乙醇溶液，混合均勻后定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，即為配置完成的濃度為1.5 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于 10 mL 容量瓶中，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL 搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL 搖勻，放置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，再用70%乙醇溶液稀釋至刻度，靜置15 min 后，分別在510 nm 處測定其吸光度[8]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（X，mg/mL）與吸光度（Y）的線性回歸方程 Y=11.464X+0.014 1（R2=0.991 4），見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 金線草黃酮提取率的測定

金線草黃酮的提取率采用公式（1）計算：

式中：C 為提取液中黃酮的濃度，mg/mL；V 為提取液的最終體積，mL；M 為金線草樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以金線草黃酮提取率為指標(biāo)，分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，建立了四因素三水平響應(yīng)面分析因素與水平表，如表1 所示。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對金線草黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份質(zhì)量為3.00 g 金線草粉末，分別置于錐形瓶中，按照料液比為1 ∶15（g/mL）的比例，依次加入60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液，在30 ℃下提取30 min，測定濾液中黃酮的吸光度，按照公式（1）計算金線草黃酮的提取率，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 乙醇濃度對金線草黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖2 可以看出，乙醇濃度由60%提高至70%，金線草黃酮提取率明顯升高，在乙醇濃度為70%時達(dá)到最大值；當(dāng)乙醇濃度超過70%，提取率逐漸降低。這可能是因?yàn)榻鹁€草黃酮類化合物種類繁多，且不同種類黃酮類化合物物理性質(zhì)不同的原因，即醇溶性和水溶性的差異[9]。水溶性黃酮類化合物浸出率因乙醇濃度的增加逐漸降低，與此同時，一些醇溶性雜質(zhì)和親脂類成分溶出，達(dá)到一定限度后與黃酮競爭，同乙醇水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致提取率下降。從節(jié)能和降低成本角度考慮，選取乙醇濃度70%為宜。

2.1.2 提取溫度對金線草黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份質(zhì)量為3.00 g 金線草粉末，分別置于錐形瓶中，按照料液比為 1 ∶15（g/mL）的比例，加入70%的乙醇溶液，提取溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃，提取時間為30 min，測定濾液中黃酮的吸光度，按照公式（1）計算金線草黃酮的提取率，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 提取溫度對金線草黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖 3 可知，在10 ℃～30 ℃范圍內(nèi)，金線草黃酮提取率與提取溫度呈正相關(guān)；提取溫度在30 ℃時黃酮提取率達(dá)到峰值；當(dāng)提取溫度超過30 ℃時，提取率與溫度呈負(fù)相關(guān)。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，溫度升高加快了分子運(yùn)動的速度，溶解速度也隨之加快，同時高溫也可以引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化，使黃酮類化合物由外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中[10]。所以隨著溫度升高，黃酮提取率逐漸升高，但是持續(xù)高溫會使某些黃酮化合物的結(jié)構(gòu)造到破壞，致使提取率下降。因此，提取溫度以30 ℃為宜。

2.1.3 提取時間對金線草黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份質(zhì)量為3.00 g 金線草粉末，分別置于錐形瓶中，按照料液比為1 ∶15（g/mL）的比例，加入70%的乙醇溶液，提取溫度為30 ℃，分別提取10、20、30、40、50 min，測定濾液中黃酮的吸光度，按照公式（1）計算金線草黃酮的提取率，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 提取時間對金線草黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

由圖4 可以看出，隨著提取時間延長，金線草黃酮提取率不斷升高；提取時間為30 min，黃酮提取率達(dá)到最高點(diǎn)；隨著提取時間進(jìn)一步延長，金線草黃酮提取率開始下降。其中可能的原因是提取時間一旦過長，金線草中黃酮化合物被氧化，以及溶劑揮發(fā)損失，造成金線草黃酮提取率下降。由此可得，金線草黃酮最適宜提取時間為30 min。

2.1.4 料液比對金線草黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份質(zhì)量為3.00 g 金線草粉末，分別置于錐形瓶中，依次按照 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1 ∶30（g/mL）的料液比，加入70%的乙醇溶液，在30 ℃下提取30 min，測定濾液中黃酮的吸光度，按照公式（1）計算金線草黃酮的提取率，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 料液比對金線草黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由圖5 可知，當(dāng)料液比小于 1 ∶25（g/mL）時，金線草黃酮提取率呈上升趨勢；料液比在1 ∶25（g/mL）時金線草黃酮提取率達(dá)到最高；當(dāng)料液比大于1 ∶25（g/mL）時，提取率反而下降。一般而言，細(xì)胞內(nèi)外金線草黃酮的濃度梯度在很大程度上取決于溶劑的用量，溶劑用量越大，細(xì)胞內(nèi)外金線草黃酮的濃度梯度越大，黃酮與溶液的接觸面積增大，在溶液中擴(kuò)散程度提高，有利于細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)的逸出。但當(dāng)溶劑用量過大時，原料中的雜質(zhì)（如可溶性的多糖、蛋白質(zhì)、果膠）溶出，這些雜質(zhì)可能吸附黃酮或者是與黃酮結(jié)合[11]，因而使得黃酮提取率不升反降。所以從提高工作效率以及節(jié)約能源的角度考慮，料液比取1 ∶25（g/mL）為宜。

2.2 金線草黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

為了得到乙醇回流提取金線草黃酮的最佳工藝條件，根據(jù)表1 中響應(yīng)面分析因素和水平，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）和提取溫度（D）作為自變量，以金線草黃酮提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合，試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 The results of response surface analysis

由表2 可得，試驗(yàn)設(shè)計總共29 組，其中零點(diǎn)試驗(yàn)5 組，析因試驗(yàn) 24 組。

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert8.0.6 軟件對該響應(yīng)面進(jìn)行分析，得四元二次回歸模型方程如下：

回歸分析結(jié)果見表3。表中P 值可以表示回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，且相應(yīng)變量的顯著程度與P 值呈負(fù)相關(guān)，即P 值越小，該變量的顯著性越來越高。

表3 響應(yīng)面回歸分析結(jié)果Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance table

由表3 可以看出，該模型達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型與實(shí)際情況擬合度較好。一次項(xiàng)乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）和提取溫度（D）對模型影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)CD（料液比和提取溫度）交互作用顯著（P＜0.05）；各因素二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2的影響均達(dá)到極顯著水平 （P＜0.01），從而進(jìn)一步說明了各因素對響應(yīng)面的影響不是單純的線性關(guān)系。比較各因素對金線草黃酮提取率的影響程度，由大到小順序依次為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞料液比。

結(jié)合回歸數(shù)學(xué)模型分析，對上述二次回歸方程求解，可得到最佳提取工藝條件：溫度39.86 ℃、時間40.31 min、乙醇濃度 77.02%、料液比 1 ∶23.82（g/mL）?？紤]工藝的可操作性，將參數(shù)調(diào)整為：溫度40 ℃、時間40 min、乙醇濃度 75%、料液比 1 ∶25（g/mL）。在此條件下，黃酮理論提取率為2.05%。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

為了更直觀地表現(xiàn)各因素交互作用對黃酮提取率的影響，采用 Design Expert8．0．6 軟件處理數(shù)據(jù)，所得等高線與三維響應(yīng)曲面見圖6～圖11。響應(yīng)面開口均向下，響應(yīng)面值均隨每個因素增大而增大，當(dāng)達(dá)到極值后，響應(yīng)面值逐漸減小。

圖6 乙醇濃度和提取時間對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.6 The effect of alcohol concentration and extraction time on contour map and the response surface

圖7 乙醇濃度和料液比對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.7 The effect of alcohol concentration and solid liquid ratio on contour map and the response surface

圖8 乙醇濃度和溫度對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.8 The effect of alcohol concentration and extraction temperature on contour map and the response surface

圖9 提取時間和料液比對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.9 The effect of alcohol concentration and solid liquid ratio on contour map and the response surface

圖10 提取時間和溫度對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.10 The effect of extraction time and temperature on contour map and the response surface

圖11 料液比和溫度對黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.11 The effect of solid liquid ratio and extraction temperature on contour map and the response surface

2.3 最佳工藝條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的有效性，進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，所得金線草黃酮平均提取率為2.34%，高于理論預(yù)測值（2.05%），表明預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合性。同時，采用超聲波輔助提取工藝與之相比較，在料液比為 1 ∶23（g/mL），乙醇濃度為 75%，超聲波提取時間為11 min 條件下，所得提取率為2.576%，而本試驗(yàn)所選用的回流提取法可以通過延長提取時間，來獲得與超聲波提取法相近的提取效果，從而表明該回歸數(shù)學(xué)模型可以很好地預(yù)測不同條件下的提取率，具有一定的實(shí)用價值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙醇回流法提取金線草中的黃酮類化合物，逐一研究影響提取結(jié)果的4 個因素：乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比，并采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計，建立了金線草黃酮提取工藝的數(shù)學(xué)模型。該回歸模型顯示了金線草黃酮提取率與4 個因素之間的關(guān)系，能很好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。

對該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，得出金線草黃酮提取的最佳工藝條件：乙醇濃度75%、提取時間40 min、提取溫度 40 ℃、料液比 1 ∶25（g/mL）。在此條件下，金線草黃酮提取率為2.34%，高于理論預(yù)測值（2.05%），表明該數(shù)學(xué)模型對黃酮類化合物的提取工藝具有一定的理論價值，對金線草資源的綜合利用和黃酮產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)具有較強(qiáng)的實(shí)踐指導(dǎo)意義。