林家猛，李立華

(1.云南省玉溪市中醫(yī)院藥學(xué)部，云南 玉溪 653100； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230031)

肺纖維化在臨床上被稱為“間質(zhì)性肺炎”，其初期病理特征主要表現(xiàn)為各類急性炎癥，學(xué)術(shù)界對其發(fā)病機制尚未有共識[1-2]。在中國，肺纖維化的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前臨床上多采用免疫抑制藥和腎上腺皮質(zhì)激素治療肺纖維化，但該治療方案可造成繼發(fā)感染，且不良反應(yīng)較為嚴(yán)重[3]。漢代名醫(yī)張仲景《金匱要略》中的經(jīng)典方劑——瓜蔞薤白湯，在臨床上治療胸痹取得了良好的療效[4]。筆者的前期研究顯示，其對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化具有一定的治療效果，但尚未對其治療機制進行相應(yīng)的研究。本研究將探討瓜蔞薤白湯對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響，從而初步明確其對肺纖維化的干預(yù)機制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠40只，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002，動物使用許可證號為SYXK(皖)2011-007]，體質(zhì)量160～200 g，周齡6～7周，所有大鼠均不帶有人獸共患病原、烈性傳染病病原、常見傳染病病原及對動物危害大和對研究干擾大的病原，且所有大鼠具有相同遺傳背景。實驗前對其進行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，保證大鼠可自由進食、飲水，維持正常的晝夜規(guī)律，設(shè)置環(huán)境濕度50%左右，溫度24 ℃左右。大鼠所用飼料為標(biāo)準(zhǔn)飼料，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗用藥 強的松(批號 110465)由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)；瓜蔞(批號20121103)、薤白(批號 20121015)均由深南中藥飲片公司提供，購入后均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任中藥師李立華進行相應(yīng)鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參考《中華人民共和國藥典》2015年版。瓜蔞薤白湯是通過正交試驗驗證的提取方案獲得的濃縮醇提取物。臨用時由生理鹽水配成使用濃度。

2 方法

2.1 動物分組及模型復(fù)制 結(jié)束適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將大鼠隨機分成正常對照組、模型組、陽性對照組(按照3.6 mg/kg的劑量給予強的松)、瓜蔞薤白湯組(按照2.8 g/kg的劑量給予瓜蔞薤白湯)，每組10只。實驗中的藥物劑量均參考人體正常用藥量和人與大鼠體質(zhì)量的比例計算獲得。將4組大鼠通過腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，并完成氣管插管，其中模型組、陽性對照組、瓜蔞薤白湯組按照5 mg/kg的劑量注射博來霉素復(fù)制肺纖維化模型，正常對照組則根據(jù)大鼠體質(zhì)量注入同等容積的生理鹽水。隔日對陽性對照組和瓜蔞薤白湯組通過灌胃給予相應(yīng)的治療藥物，正常對照組、模型組則根據(jù)大鼠體質(zhì)量給予同等容積的生理鹽水灌胃，各組每日灌胃1次，每周均根據(jù)大鼠的體質(zhì)量變化對用藥量進行相應(yīng)的調(diào)整，給藥持續(xù)28 d。一般20 d后便可取出大鼠肺組織進行檢測，當(dāng)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞數(shù)量和膠原蛋白的沉積明顯增高時可視為模型復(fù)制成功。

2.2 大鼠生理指標(biāo)及肺組織病理檢測 第28天麻醉大鼠后選擇股動脈放血法處死大鼠。及時取出各組大鼠肺組織，并稱質(zhì)量和觀察大體形態(tài)，統(tǒng)一留取各組大鼠左下肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。將剩下的肺組織保存于-80 ℃的冰箱中，以備其他指標(biāo)的檢測。肺系數(shù)=肺濕質(zhì)量/體質(zhì)量。取經(jīng)過固定的肺組織，依據(jù)病理學(xué)方法步驟進行脫水、包埋、切片等操作，分別行Masson和蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。根據(jù)Szapiel等[5]的方案對大鼠進行肺炎癥狀評分，選擇單盲法于各組樣本中隨機選取8個視野觀察肺泡炎癥并分級，0級計1分，1級計2分，2級計3分，3級計4分。具體評級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

依據(jù)Ashcroft等[6]的方案對肺纖維化癥狀進行評分，選擇單盲法于各組樣本中隨機選取8個視野觀察肺泡纖維化程度并分級。具體評級標(biāo)準(zhǔn)見表2。0級計1分，1級計2分，2級計3分，3級計4分，每組8個樣本分別評分，并計算平均值。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平 取經(jīng)多聚甲醛固定的肺組織切片后脫蠟，進行抗原修復(fù)，滴加磷酸化蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phospho-protein kinase RNA-like ER kinase，p-PERK)、磷酸化肌醇蛋白酶1α(phospho-inositol-requiring enzyme 1α，p-IRE1α)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)或激活轉(zhuǎn)錄因子6α(activating transcription factor 6α，ATF6α)抗體(按照1∶80進行配制)，孵育時放置于4 ℃環(huán)境中過夜。通過DAB進行顯色，接著使用蘇木精進行復(fù)染，隨機取各切片中的200倍視野10個，從各組隨機選取切片4張，圖像采集選擇Olympus公司圖像采集系統(tǒng)，半定量分析則通過Image-Pro Plus圖像分析軟件進行，目的蛋白表達的計算選擇積分光密度(integral optical density,IOD)與面積比值法。

表1 肺炎癥狀評級標(biāo)準(zhǔn)

表2 肺纖維化癥狀評級標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺的大體形態(tài)學(xué)變化和肺系數(shù)比較 正常對照組大鼠的肺臟為粉紅色，外觀基本正常，肺泡壁彈性正常且光滑；模型組大鼠肺顏色較暗，部分可呈現(xiàn)灰白色，存在分布均勻的點狀瘀血斑；陽性對照組與瓜蔞薤白湯組大鼠肺顏色較模型組紅潤，可見少量灰白色部位和點狀瘀血斑。模型組大鼠的肺系數(shù)相較于其他3組均明顯增加(P<0.05)；且陽性對照組的肺系數(shù)顯著高于瓜蔞薤白湯組大鼠(P<0.05)。見表3。

3.2 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化比較 HE染色后光鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠肺泡壁較薄，具有完整的肺泡結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤或充血等情況；模型組大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現(xiàn)塌陷，部分可見融合成大肺泡，肺泡中具有明顯的炎癥細胞浸潤或充血等情況；陽性對照組與瓜蔞薤白湯組大鼠的炎癥程度相較于模型組顯著減輕(P<0.05)；陽性對照組與瓜蔞薤白湯組大鼠的肺仍可保持肺泡結(jié)構(gòu)，但肺泡間隔存在局部變厚，肺泡較少存在融合。見表3、圖1。Masson染色后光鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠具有完整肺泡結(jié)構(gòu)，無藍色膠原在肺泡間隙沉積；模型組大鼠雙肺喪失了絕大部分肺泡結(jié)構(gòu)，可見藍色膠原大量沉積于間質(zhì)，肺部實變，其纖維化程度相較于陽性對照組和瓜蔞薤白湯組大鼠明顯增加(P<0.05)；陽性對照組與瓜蔞薤白湯組大鼠肺泡間隔的膠原沉積情況較輕，其纖維化程度與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠肺臟組織形態(tài)學(xué)變化比較(10×10倍)

組 別n肺系數(shù)/(g/g)炎癥程度評分纖維化程度評分正常對照100.004 1±0.000 1?1.12±0.08?0.16±0.03?模 型100.005 8±0.000 23.47±0.296.55±0.71陽性對照100.004 6±0.000 2?1.58±0.13?0.11±0.02?瓜蔞薤白湯100.004 3±0.000 1?#1.62±0.18?0.17±0.09?

注：與模型組比較，*P<0.05，與陽性對照組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和瓜蔞薤白湯組大鼠肺組織中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，瓜蔞薤白湯組大鼠肺組織中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

4 討論

細胞外基質(zhì)的異常沉積導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)被取代和肺成纖維細胞聚集是肺纖維化的重要病理特征[7]。目前，與人類肺纖維化病理學(xué)變化相似度最高的模型是博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化。前期的文獻研究顯示，肺纖維化在博來霉素經(jīng)氣管注入大鼠后14 d就可形成[8]。而強的松作為臨床上廣泛使用的糖皮質(zhì)激素，可以控制肺纖維化，在藥理學(xué)研究中也可用作抗肺纖維化藥物篩選的陽性對照藥。本研究中，模型組大鼠肺組織病理結(jié)果顯示大鼠肺泡壁變厚，眾多肺泡出現(xiàn)塌陷，部分可見融合成大肺泡，肺泡中具有明顯的炎癥細胞浸潤或充血等情況，而Masson染色結(jié)果則顯示藍色膠原大量沉積于間質(zhì)，肺部實變。以上證據(jù)都表明博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型復(fù)制成功。而瓜蔞薤白湯對于博來霉素造成的炎癥反應(yīng)可發(fā)揮較好的治療效果，同時可改善纖維化程度和藍色膠原在肺泡間隙沉積，提示瓜蔞薤白湯對博來霉素所致大鼠肺纖維化具有較好的治療效果。

圖2 各組大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達情況(免疫組織化學(xué)法，10×10倍)

組 別np-PERKp-IRE1αGRP78ATF6α正常對照100.005 5±0.002 3?0.007 2±0.006 8?0.015 7±0.004 8?0.006 4±0.002 5?模 型100.031 4±0.011 30.033 1±0.010 90.035 2±0.009 60.026 3±0.005 3陽性對照100.006 7±0.001 2?0.009 7±0.007 3?0.016 9±0.007 4?0.008 2±0.003 5?瓜蔞薤白湯100.007 1±0.001 8?0.009 5±0.005 9?0.017 5±0.008 3?0.009 1±0.004 2?

注：與模型組比較，*P<0.05

瓜蔞薤白湯作為臨床應(yīng)用中的經(jīng)典方劑，其適應(yīng)證主要有胸背徹痛、喘息咳唾、短氣等，對于胸痹具有顯著的療效[9]。該方的組成為薤白和瓜蔞，其中瓜蔞主要發(fā)揮滌痰散結(jié)、理氣寬胸的作用；薤白則發(fā)揮通陽散結(jié)、溫通滑利、行氣止痛之功效，經(jīng)過配伍后可發(fā)揮保護缺血心肌，抗低氧及阻止血小板的聚集等作用[10-11]。對于瓜蔞薤白湯的研究重點目前主要集中在藥理活性及臨床應(yīng)用方面，而對其發(fā)揮作用的相關(guān)機制研究較少[12]。

為進一步確定瓜蔞薤白湯對大鼠肺纖維化發(fā)揮治療作用機制，筆者通過免疫組織化學(xué)法對模型組和瓜蔞薤白湯組大鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達進行檢測。結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表達水平相較于正常對照組大鼠顯著升高，而經(jīng)過瓜蔞薤白湯干預(yù)后p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表達水平顯著降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核生物中的細胞器，其主要在合成脂類、蛋白質(zhì)折疊及生成糖原等多方面發(fā)揮重要影響[13]。當(dāng)機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激、化學(xué)損傷及營養(yǎng)缺乏等因素刺激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相關(guān)功能均會受到影響，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)蓄積而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]。越來越多的文獻報道顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與肺纖維化的發(fā)病過程中[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可作用于PERK、ATF6及IRE1等相關(guān)通路，進而促進細胞凋亡、刺激炎癥反應(yīng)等促進肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[16]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶GRP78結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的未折疊蛋白中ATF6、PERK和 RE1 3個跨膜蛋白，此時細胞可處在穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)受到相關(guān)刺激時，其原本的結(jié)合狀態(tài)會出現(xiàn)解離，從而使未折疊蛋白的3條通路被激活，未折疊蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感蛋白，發(fā)生反應(yīng)后其表達可發(fā)生上調(diào)[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過激活A(yù)TF6、PERK和IRE1 3條通路引起炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而導(dǎo)致肺纖維化的形成。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠GRP78呈現(xiàn)高表達，而經(jīng)過瓜蔞薤白湯干預(yù)后GRP78的表達受到抑制。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時跨膜蛋白PERK的激活通過磷酸化進行，進而磷酸化eIF2α，最終活化核因子κB引發(fā)炎癥反應(yīng)[18]。本實驗結(jié)果顯示，瓜蔞薤白湯可顯著抑制博來霉素激活的PERK磷酸化程度。IRE1α主要作用于c-Jun氨基末端激酶信號通路來引發(fā)炎癥及凋亡反應(yīng)[19]。本實驗結(jié)果同樣表明，瓜蔞薤白湯可顯著抑制博來霉素激活的IRE1α磷酸化程度?；罨腁TF6作用于P38，進而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，經(jīng)瓜蔞薤白湯干預(yù)后，ATF6α的表達水平相較于模型組顯著降低。綜合本實驗結(jié)果，提示瓜蔞薤白湯可顯著抑制博來霉素激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的3條通路。文獻報道顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用于未折疊蛋白反應(yīng)的3條通路，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細胞凋亡等[20]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，瓜蔞薤白湯治療博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)?？傊?，通過瓜蔞薤白湯對肺纖維化大鼠的治療作用及可能機制的研究，為其臨床治療肺纖維化提供了新的證據(jù)。