鐘正靈，江玉華，楊沿浪，張 飛，張煒婷，童九翠，李 娟，儲(chǔ)冀汝，謝海棠*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 《中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)》編輯部，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)，安徽 蕪湖 241000；3.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腎內(nèi)科，安徽 蕪湖 241000；4.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)，安徽 蕪湖 241000；5.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 臨床藥物評(píng)價(jià)中心，安徽 蕪湖 241000)

急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)是各種間接和直接致傷因素(包括機(jī)械因素、化學(xué)因素、生物因素)導(dǎo)致的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞損傷，致使急性低氧性呼吸功能不全。以通氣/血流比例失調(diào)、肺順應(yīng)性降低、肺容積減少為病理生理特征，臨床上表現(xiàn)為呼吸窘迫和進(jìn)行性低氧血癥，其嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征。多中心流行病學(xué)研究結(jié)果提示中國(guó)ALI的病死率遠(yuǎn)高于西方發(fā)達(dá)國(guó)家[1-2]。ALI具有較高的死亡率和發(fā)病率，并且近年呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，目前仍缺乏有效的治療方法，對(duì)該病的治療及其發(fā)病機(jī)制的研究一直以來(lái)都是危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[3-5]。

目前臨床上主要使用糖皮質(zhì)激素、利索茶堿、表面活性劑、N-乙酰半胱氨酸和魚(yú)油等藥物治療ALI，這些藥物對(duì)ALI有一定的作用，但同時(shí)存在各種毒副作用，治療效果均不理想[6-8]。雖然國(guó)內(nèi)外針對(duì)ALI治療的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)也較多，但目前尚無(wú)特效的治療藥物。

當(dāng)歸可預(yù)防和治療放射性肺損傷[9]。當(dāng)歸須散能顯著降低急性肺挫傷患者炎性細(xì)胞因子水平，抑制炎性反應(yīng)，阻斷肺損傷的演變進(jìn)程，縮短康復(fù)時(shí)間[10]。阿魏酸(Ferulic Acid，F(xiàn)A)是從當(dāng)歸中提取的有效活性成分之一。文獻(xiàn)研究表明阿魏酸在當(dāng)歸中的含量為0.06%[11]，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)顯示，當(dāng)歸含藥血清主要成分含有阿魏酸[12-13]。當(dāng)歸對(duì)肺損傷的保護(hù)作用是否是阿魏酸發(fā)揮藥效作用尚未可知。因此，實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠為研究對(duì)象，探討阿魏酸對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠是否具有保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

阿魏酸(含量為98%，使用時(shí)用生理鹽水進(jìn)行配制)，購(gòu)于南京建成生物工程研究所(批號(hào)：F103701)；脂多糖，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：1020031)；地塞米松磷酸鈉注射液，購(gòu)于辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：1708232121)；無(wú)水乙醇、戊巴比妥試劑均為市售分析純。TNF-α試劑盒(批號(hào)：RK00027)、IL-6試劑盒(批號(hào)：RK00008)、IL-1β試劑盒(批號(hào)：RK00006)，均購(gòu)于ABclonal Biotechnology Co.，Ltd。

1.2 儀器與設(shè)備

UPT-Ⅱ-20T型超純水器(成都超純科技有限公司)；電子分析天平(FA1004)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo XIR)；FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；50 uL微量進(jìn)樣器(上海高河工貿(mào)有限公司)；ELISA專用微量振蕩器(MX-100-4A，杭州奧盛儀器有限公司)；LRHS恒溫干燥箱(DHG-9023A，東莞環(huán)瑞環(huán)境測(cè)試設(shè)備廠)；RM2245型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物

BALB/c小鼠，(20±2) g，雄性，SPF級(jí)，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0001，動(dòng)物合格證號(hào):201704335。

1.4 分組與給藥

60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，模型組，阿魏酸高(30 mg/kg)、中(15 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)和地塞米松組(2 mg/kg)，每組10只。灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，每天1次。連續(xù)給藥7 d，末次給藥后2 h，正常對(duì)照組給予同體積生理鹽水，其余各組均通過(guò)微量進(jìn)樣器氣管快速滴注脂多糖(10 mg/kg)[14]，禁食不禁水，造模6 h后，小鼠眼部采血，處死小鼠，迅速取出小鼠的肺組織。

1.5 肺組織濕/干重比值測(cè)定

取出小鼠的右肺上葉，除去結(jié)締組織，用生理鹽水清洗數(shù)次并用濾紙吸干后稱濕重，放在80 ℃恒溫干燥箱中連續(xù)干燥72 h以上，分別稱量肺組織干重并記錄，計(jì)算小鼠肺組織濕/干重比值[15]。

1.6 ELISA法測(cè)定血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.7 肺組織病理學(xué)觀察

取小鼠左肺上葉肺組織適量，將肺組織固定于多聚甲醛溶液中，24 h后取出，用生理鹽水充分沖洗后甲酸脫鈣，并進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制備蠟塊，使用切片機(jī)切成超薄切片，去石蠟，并用蘇木素-伊紅染液染色，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照以及圖像分析觀察肺組織形態(tài)改變(×200)。

圖1 阿魏酸對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響(x±s，n=10)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織濕/干重比值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組與阿魏酸高、中、低劑量組小鼠肺組織濕/干重比值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿魏酸對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響如圖1所示。由圖1可知，阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠肺組織水腫。

2.2 阿魏酸對(duì)急性肺損傷小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組與阿魏酸高、中、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠肺組織濕/重比值及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量如表1所示，結(jié)果表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠血清炎癥因子水平。

表1 各組小鼠肺組織濕/重比值及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

與正常對(duì)照組比較，bP<0.05；與模型組比較，eP<0.05。

2.3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔之間無(wú)水腫，肺組織未見(jiàn)明顯病理改變；模型組肺組織可見(jiàn)肺泡間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔縮小，含有較多的炎性細(xì)胞；地塞米松組上述變化明顯減輕；阿魏酸低、中、高劑量組上述變化依次減輕，僅見(jiàn)肺泡間隔少量炎性細(xì)胞。各組小鼠的肺組織病理形態(tài)學(xué)變化如圖2所示。

圖2 各組小鼠的肺組織病理形態(tài)學(xué)變化圖(×200)

3 討論

ALI是由多種原因?qū)е碌募毙院粑δ苷系K，彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，肺內(nèi)失控的炎癥細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞的大量釋放為其主要病理表現(xiàn)[16-17]。耿焱[18]等對(duì)勞力型與經(jīng)典型熱射病大鼠急性肺損傷的病理特點(diǎn)及時(shí)程變化進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性肺損傷大鼠損傷早期病理改變主要為少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，中暑6 h后肺臟損傷加重，肺泡結(jié)構(gòu)模糊，間質(zhì)血管顯著擴(kuò)張充血，出現(xiàn)肺泡腔出血；中暑24 h后大鼠肺損傷進(jìn)一步加重，肺泡間隔和肺泡中充滿了大量紅細(xì)胞，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)肺間質(zhì)，間質(zhì)明顯增厚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，阿魏酸高、中、低劑量組肺濕/干重比值明顯降低，表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠肺組織水腫。病理圖片顯示模型組肺泡間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔縮小，含有較多炎性細(xì)胞；阿魏酸高、中、低劑量組上述變化明顯減輕，僅見(jiàn)肺泡間隔內(nèi)少量炎性細(xì)胞。

脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，可直接作用于肺組織，破壞肺泡引起出血、肺水腫，使壞死組織、炎性細(xì)胞堆積，促使肺泡巨噬細(xì)胞和炎性反應(yīng)鏈的激活，導(dǎo)致肺內(nèi)炎性反應(yīng)[19]。TNF-α是導(dǎo)致急性肺損傷的關(guān)鍵細(xì)胞因子，主要來(lái)源于脂多糖刺激T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。TNF-α能導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放，并進(jìn)一步激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。IL-6是由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，涉及肺內(nèi)炎癥的過(guò)度反應(yīng)，是肺內(nèi)主要的炎癥因子之一[21]。TNF-α和IL-6均具有觸發(fā)炎癥反應(yīng)的作用[22]。IL-1β是由激活的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞所分泌，IL-1β是炎癥放大啟動(dòng)因子，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，阿魏酸高、中、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明顯降低，表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠血清炎癥因子水平。