鐘 寶，李鳳林，王英臣，劉靜雪，Youn-Soo Cha

膠陀螺(Bulgaria inquinans) 又名豬嘴蘑、拱嘴蘑、膠鼓菌，主要分布在我國東北長白山一帶，夏、秋季節(jié)常見于蒙古櫟的倒木及樹樁上。經研究，膠陀螺具有很高的藥用價值，如抗癌、抑菌、光敏、抗瘧疾、抗氧化、止癢、殺蟲、抗血瘀等，現代科學研究表明，膠陀螺多糖具有光敏、抗腫瘤和減少血栓形成等活性[1]。目前，對于膠陀螺多糖提取方法的研究報道相對較少。超高壓技術是將設備壓力上升到100 MP以后，迫使細胞在超高壓作用下產生細胞壁破裂，細胞內的物質能夠最大限度溶出的一種方法[2-5]。隨著食品加工業(yè)的發(fā)展和功能性食品生產的需要，該項技術目前廣泛用于食品加工行業(yè)[6-9]。本文以為膠陀螺為原料，通過超高壓輔助萃取技術提取多糖，通過單因素和響應面分析試驗確定最佳提取工藝參數，為膠陀螺綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

膠陀螺采自于蛟河市黃松甸鎮(zhèn)；超純水，實驗室制??；苯酚、硫酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器設備

超高壓裝置：包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司；SBW-1型旋轉蒸發(fā)儀：上海申玻儀器公司；TU1800S型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；BS110S 精密電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LXB-IIB 低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；實驗室超純水機：深圳市宏森環(huán)保科技有限公司。

1.3 工藝流程

原料→烘干→粉碎→與蒸餾水混合→超高壓提取→抽濾→乙醇沉淀→去蛋白→靜置過夜→離心→無水乙醇洗滌→稀釋粗多糖提取液→測定。

1.4 操作要點

(1)將新鮮的膠陀螺子實體置于烘干箱中，在80 ℃的條件下烘干3 h，取出粉碎，過80目篩，制成粉末待用。(2)取粉末10 g，置于燒瓶中，加入200 mL蒸餾水溶解，之后進行超高壓處理。(3)對水提液進行抽慮，加95%的乙醇至乙醇濃度達到80%進行醇沉，加入Sevag試劑脫去蛋白，加入4倍的無水乙醇沉淀，在4 ℃的條件下，靜止放置12 h。(4)在4 000 r/min的條件下，離心5 min得到沉淀，之后用無水乙醇洗滌，再進行冷干，即可得到粗多糖。

1.5 多糖含量測定[10-11]

苯酚—硫酸比色法測定膠陀螺中多糖含量。

表1 響應面分析因素與水平編碼值和實際值范圍表

1.6 響應面試驗設計[12-14]

在單因素試驗的基礎上，選取保壓時間、料液比和超高壓壓力三個因素(見表1)，根據Box-Behnken設計原理，進行響應面分析試驗，以膠陀螺多糖得率為響應值，每組試驗重復3次，計算平均值，使用輔助軟件Design-Expert 8.0.6進行隨機試驗。

2 試驗結果和分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超高壓力對試驗結果的影響 在0-500 MPa的超高壓條件下，對膠陀螺多糖進行提取，提取結果見圖1。

圖1 超高壓壓力對膠陀螺多糖得率的影響

圖2 保壓時間對多糖得率的影響

圖3 料液比對膠陀螺多糖得率的影響

由圖1可知，在保壓時間(5 min)和料液比(1∶20 g/mL)恒定的條件下，隨著超高壓壓力的上升，膠陀螺多糖的得率也在逐漸增加，當提取壓力超過300 MPa以后，多糖得率開始呈下降趨勢，原因可能是，由于壓力過高導致膠陀螺細胞壁破裂，常規(guī)條件下，壓力可以輔助溶液溶出多糖，但壓力超過一定范圍，會致使細胞完全破裂，細胞中的其他物質也隨之溶出，導致雜質過多阻止了多糖的溶出。

2.1.2 保壓時間對多糖得率的影響 在保壓時間為0-7 min的條件下提取多糖，結果見圖2。

由圖2可知，在超高壓壓力(300 MPa)和料液比為(1∶20 g/mL)恒定的條件下，隨著時間的增加多糖的得率也隨之增加，當時間超過5 min后，多糖得率逐漸開始下降，原因可能是當保壓時間到達5 min時，膠陀螺細胞已經破裂，如果繼續(xù)增加壓力，會導致細胞破裂過度，產生大量雜質，進而對多糖的溶出產生影響。

2.1.3 料液比對膠陀螺多糖得率的影響 在1∶10 g/mL-1∶30 g/mL的條件下進行多糖提取，結果見圖3。

在超高壓壓力(300 MPa)和保壓時間(5 min)恒定的條件下，溶液計量的增加，使得多糖得率也逐漸增加，當料液比超過1∶20 g/mL時，多糖得率變化不明顯，在膠陀螺重量恒定的條件下，溶劑用量增加，細胞內外的多糖濃度差增大，有利于多糖的溶出，當多糖基本溶出時，繼續(xù)增加溶劑的使用量，不利于后續(xù)試驗的開展。

2.2 響應面試驗結果和分析

2.2.1 響應面試驗設計 通過單因素試驗，選擇超高壓壓力(A)、保壓時間(B)和料液比(C)3個單因素為自變量，以膠陀螺多糖得率為響應值(Y)，采用響應面分析法進行三因素三水平試驗(17組實驗)，結果見表2。

2.2.2 膠陀螺多糖超高壓輔助提取回歸模型、方差分析及顯著性檢驗 采用軟件對表2中的結果進行多元回歸模型擬合、方差分析及顯著性分析。得到多糖得率對超高壓壓力、保壓時間、料液比的初步回歸方程為：

Y=+4.99-0.020A-0.11B+014C+0.061AB+0.023AC+0.018BC-0.47A2-0.33B2-0.44C2

對該模型進行顯著性分析，結果見表3和表4。

表2 膠陀螺多糖超高壓輔助提取響應面優(yōu)化試驗結果與分析

表3 回歸方程方差分析表

注 ：“**”差異極顯著(P<0.01)；“*”差異顯著(P<0.05) ；“—”差異不顯著。

表4 回歸模型的可信度分析

根據表3和表4的分析結果可知，P<0.000 1，表明該模型極為顯著，回歸模型和實際值擬合度較好，試驗操作的誤差相對較小，所以，該方程可以代替實驗的真實值，對試驗結果進行細致分析。同時R2=98.19%，這表明，預測結果與測定結果保持著高度相關性，方程具有較高的可靠性，在回歸模型中B、C、A2、B2、C2對響應值影響極顯著。

2.2.3 各因素交互作用對膠陀螺多糖得率的影響 交互作用對膠陀螺多糖得率的響應面分析見圖4。

圖4 交互作用極顯著因素響應面及等高線圖

通過圖4可以看出，各個試驗因素的交互作用較為顯著，各個因素對結果的影響權重分別為：保壓時間(B)> 料液比(C)>超高壓壓力(A)。通過對回歸模型方程進行求解，得到的膠陀螺多糖最佳的提取工藝為：保壓時間為5 min、料液比1∶20 g/mL、超高壓壓力300 Mpa，此條件下多糖得率可達5.03%。試驗測定值和理論值比較相近，說明此模型可優(yōu)化膠陀螺多糖提取工藝參數。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和響應面分析法，對膠陀螺多糖提取工藝進行優(yōu)化，對保壓時間、料液比和超高壓壓力三個關鍵因素進行了研究。試驗結果表明，在保壓時間為5 min、料液比為1∶20 g/mL、超高壓力為300 Mpa的條件下，多糖得率可以達到5.03%，這表明該回歸方程較真實地反應出各因素對膠陀螺多糖提取得率的影響，試驗測定值和理論值比較相近，能夠說明此模型可優(yōu)化膠陀螺多糖提取工藝參數。