周 琳，潘曉燕

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

目前中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常使用大量的有機(jī)磷農(nóng)藥[1]，對(duì)水中的動(dòng)植物產(chǎn)生嚴(yán)重污染.當(dāng)今國內(nèi)學(xué)者主要研究集中在農(nóng)藥對(duì)魚類等多細(xì)胞動(dòng)物的毒性影響，而在原生動(dòng)物草履蟲研究方面數(shù)據(jù)還比較少.草履蟲是最簡單的原生動(dòng)物代表[2]，在水中運(yùn)動(dòng)速度快，能和水中的物質(zhì)緊密接觸，對(duì)毒性的敏感度遠(yuǎn)高于多細(xì)胞動(dòng)物，是研究河水中是否具有有毒物質(zhì)的一種較為理想的實(shí)驗(yàn)材料.筆者經(jīng)過探究不同濃度的養(yǎng)樂果、吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲的急慢性毒性作用，探索不同濃度的3種農(nóng)藥對(duì)草履蟲的生長和種群密度的影響，從而為進(jìn)一步研究農(nóng)藥的安全、水質(zhì)檢測和生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和事實(shí)依據(jù)[3].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

所用草履蟲采集于周口川匯區(qū)的生活污水.

1.1.2 藥品

40%的養(yǎng)樂果；10%吡蟲啉；2.5%的高效氯氟氰菊酯.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器具

顯微鏡、解剖鏡、LRH-250-CT光照恒溫培養(yǎng)箱、移液槍、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒、容量瓶.

1.2 方法

1.2.1 制備稻草液

稻草培養(yǎng)液是草履蟲培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)液之一.稻草培養(yǎng)液的制備：新鮮稻草稈采集于周口公園附近，并剪成2 cm左右的小段，按照100 mL水中加入1 g稻草的比例進(jìn)行配制，在燒杯中煮沸15 min[4].待稻草液顏色變成黃褐色后停止加熱，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值.在燒杯上面蓋雙層紗布，扎緊，放在實(shí)驗(yàn)室靜置24 h.

1.2.2 草履蟲的采集

草履蟲喜歡生活在陽光充足，并含有腐草的水溝、池塘或生活污水中[5]，尤其喜歡生活在細(xì)菌豐富的水域中[6].本實(shí)驗(yàn)所采用的草履蟲采集于周口市川匯區(qū)內(nèi)的生活污水，時(shí)間在4月份左右，水溫為20 ℃左右.采集后可對(duì)著光源用肉眼進(jìn)行觀察，如同針尖大小快速游動(dòng)的就是草履蟲.

1.2.3 草履蟲的純化

應(yīng)用微量分離法[7].每次用移液槍取0.01 mL含草履蟲的水體滴到載片上，經(jīng)不斷重復(fù)分離鏡檢，直到得到不含其他任何雜質(zhì)的純凈草履蟲.將得到的純凈草履蟲加入稻草培養(yǎng)液中，在25 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右[8].

1.2.4 草履蟲的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

測量計(jì)數(shù)前，先將待測的培養(yǎng)液充分搖勻[9]，用移液槍取0.01 mL培養(yǎng)液采樣并進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，得到草履蟲個(gè)數(shù)并計(jì)算其種群密度.

1.2.5 實(shí)驗(yàn)處理方法

用稻草培養(yǎng)液分別配制養(yǎng)樂果、吡蟲啉、高效氯氟氰菊酯的稀釋液，其中養(yǎng)樂果試劑配制濃度分別為0.05,0.08,0.10,0.15,0.20,0.50,0.80,1.00 mg/L，吡蟲啉試劑配制濃度為25,50,80,100,120,150,200 mg/L，高效氯氟氰菊酯試劑配制濃度分別為0.20,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00,20.00 mg/L，每種試劑每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，并設(shè)置3組空白對(duì)照，空白對(duì)照組為不添加任何試劑的稻草培養(yǎng)液.在每個(gè)試管內(nèi)均加入0.1 mL含有不同濃度藥劑的稻草液，并放入10個(gè)生活狀態(tài)良好的草履蟲，然后放置在25 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).急性毒性實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間為1 h，慢性毒性實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間為48 h.待1 h和48 h后對(duì)草履蟲的存活個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)，并記錄.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

取毒性稻草培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢，計(jì)數(shù)出0.1 mL培養(yǎng)液內(nèi)草履蟲的死亡個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出草履蟲1 h急性毒性的死亡率，并確定不同農(nóng)藥對(duì)草履蟲的完全致死濃度含量以及最小致死濃度的含量.在48 h后，從每管待測液中取出草履蟲進(jìn)行鏡檢，計(jì)數(shù)出草履蟲的存活個(gè)數(shù).并計(jì)算出0.1 mL內(nèi)的草履蟲的種群密度(種群密度=待測物種的個(gè)數(shù)/待測體積)[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 急性攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 養(yǎng)樂果的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)下，1 h后計(jì)算每個(gè)試管內(nèi)草履蟲的死亡個(gè)數(shù)，結(jié)果如表1所示.

表1 養(yǎng)樂果對(duì)草履蟲1 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液

在空白對(duì)照中，草履蟲的死亡率為0；當(dāng)濃度為0.05 mg/L時(shí)，草履蟲才開始死亡；而在濃度為1.00 mg/L時(shí)，草履蟲全部死亡，死亡率高達(dá)100%.同時(shí)隨著養(yǎng)樂果濃度的不斷增長，草履蟲的死亡個(gè)數(shù)也不斷增加.分析數(shù)據(jù)可知養(yǎng)樂果對(duì)草履蟲具有較強(qiáng)的急性毒性作用，同時(shí)也確定了養(yǎng)樂果的完全致死濃度為1.00 mg/L，最小致死濃度則為0.05 mg/L.

2.1.2 吡蟲啉的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)下，1 h后計(jì)數(shù)出每個(gè)試管內(nèi)草履蟲的死亡個(gè)數(shù)，結(jié)果如表2所示.在空白對(duì)照中，草履蟲的死亡率為0；在濃度為25 mg/L時(shí)，草履蟲開始出現(xiàn)死亡個(gè)體；而在濃度為200 mg/L時(shí)，草履蟲已經(jīng)全部死亡.同時(shí)伴隨著吡蟲啉濃度的升高，草履蟲死亡的數(shù)量也不停的增加.這說明吡蟲啉對(duì)草履蟲具有一定的毒性，同時(shí)可得吡蟲啉的完全致死濃度為200 mg/L，最小致死濃度則為25 mg/L.

表2 吡蟲啉對(duì)草履蟲1 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液

2.1.3 高效氯氟氰菊酯急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)條件下，1 h后計(jì)算每個(gè)試管內(nèi)草履蟲的死亡個(gè)數(shù)，結(jié)果如表3所示.

表3 高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲1 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液

在空白對(duì)照中，草履蟲的死亡率為0；濃度是0.20 mg/L時(shí)，草履蟲才剛開始出現(xiàn)死亡個(gè)體，并且隨著高效氯氟氰菊酯濃度的升高，草履蟲的死亡數(shù)量急劇上升；而當(dāng)濃度為20.00 mg/L時(shí)，草履蟲完全死亡.分析數(shù)據(jù)可得高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲的完全致死濃度是20.00 mg/L，而最小的致死濃度則為0.20 mg/L.

2.2 慢性急性攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 養(yǎng)樂果慢性毒性實(shí)驗(yàn)

25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，計(jì)算出每個(gè)試管內(nèi)草履蟲的存活個(gè)數(shù)以及空白對(duì)照組中的存活個(gè)數(shù)，結(jié)果如表4所示.在濃度為0.05 mg/L時(shí)，草履蟲的存活個(gè)數(shù)達(dá)到峰值，種群密度高達(dá)686.66 個(gè)/mL；在0.05～0.80 mg/ L范圍內(nèi)，隨著養(yǎng)樂果濃度的增加，草履蟲的存活個(gè)數(shù)減少，種群密度不斷下降；在濃度為1.00 mg/L時(shí)，草履蟲全部死亡.與空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，看出空白對(duì)照組中的草履蟲種群密度明顯低于濃度為0.05 mg/L的養(yǎng)樂果培養(yǎng)液，說明在一定濃度范圍內(nèi)的養(yǎng)樂果，對(duì)草履蟲種群的繁殖具有一定的促進(jìn)作用，而且濃度越低，促進(jìn)作用越明顯.

表4 養(yǎng)樂果對(duì)草履蟲48 h的慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液.

2.2.2 吡蟲啉慢性毒性實(shí)驗(yàn)

25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，計(jì)算出不同濃度的吡蟲啉中草履蟲的存活個(gè)數(shù)以及空白對(duì)照組中草履蟲的存活個(gè)數(shù)，結(jié)果如表5所示.當(dāng)濃度為25 mg/L時(shí)，草履蟲的存活個(gè)數(shù)達(dá)到峰值，種群密度最大為583.33 個(gè)/mL；在濃度25～150 mg/ L 的范圍內(nèi)，隨著吡蟲啉濃度的不斷增加，草履蟲的存活個(gè)數(shù)逐漸減少，種群密度不斷降低；濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，草履蟲全部死亡.與空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，可以看出空白對(duì)照組中的草履蟲種群密度為266.66個(gè)/mL，明顯低于濃度為25 mg/L的吡蟲啉培養(yǎng)液中草履蟲的種群密度.由此說明在一定濃度范圍內(nèi)的吡蟲啉，對(duì)草履蟲種群的繁殖具有一定的促進(jìn)作用，而且濃度越低，促進(jìn)作用越明顯.

表5 吡蟲啉對(duì)草履蟲48 h的慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液.

2.2.3 高效氯氟氰菊酯的慢性毒性實(shí)驗(yàn)

25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，計(jì)算出每個(gè)試管中草履蟲的存活個(gè)數(shù)，結(jié)果如表6所示.濃度為20.00 mg/L時(shí)，草履蟲的存活個(gè)數(shù)最多，種群的密度最高達(dá)到383.33 個(gè)/mL;在0.20～20 mg/L 范圍內(nèi)，隨著高效氯氟氰菊酯的濃度降低，草履蟲的存活個(gè)數(shù)越來越少，當(dāng)濃度為0.20 mg/L時(shí)，草履蟲的存活個(gè)數(shù)達(dá)到最低值.與空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，可看出在濃度為0.20～0.50 mg/L范圍內(nèi)的草履蟲存活個(gè)數(shù)低于空白對(duì)照組中草履蟲的存活個(gè)數(shù).可見在一定濃度范圍內(nèi)，濃度較低的高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲的生長繁衍產(chǎn)生遏制作用，而相反高濃度則會(huì)加速種群的生長繁殖.

表6 高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲48 h的慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1,2,3為三個(gè)平行組，空白為稻草培養(yǎng)液.

3 討論

在養(yǎng)樂果、吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲的1 h急性毒性實(shí)驗(yàn)中，養(yǎng)樂果濃度為0.05 mg/L時(shí)，草履蟲開始出現(xiàn)死亡，濃度為1.00 mg/L時(shí)，草履蟲全部死亡，說明養(yǎng)樂果對(duì)草履蟲的完全致死濃度為1.00 mg/L；吡蟲啉濃度為200 mg/L時(shí)草履蟲完全死亡，濃度為25 mg/L時(shí)才出現(xiàn)死亡個(gè)體，說明吡蟲啉的完全致死濃度為200 mg/L；而高效氯氟氰菊酯在濃度為0.20 mg/L時(shí)開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在濃度為20 mg/L出現(xiàn)全部死亡現(xiàn)象，說明高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲完全致死濃度為20 mg/L.上述分析數(shù)據(jù)表明三種農(nóng)藥的濃度與草履蟲的死亡率成正比，即農(nóng)藥的濃度越高，草履蟲的死亡率越大.通過對(duì)三種農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，顯示草履蟲對(duì)養(yǎng)樂果的毒性敏感度高于高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉.

在養(yǎng)樂果、吡蟲啉對(duì)草履蟲48 h慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，養(yǎng)樂果和吡蟲啉在一定濃度范圍內(nèi)，草履蟲的存活個(gè)數(shù)及種群密度與養(yǎng)樂果和吡蟲啉的濃度成反比，即養(yǎng)樂果和吡蟲啉的濃度越低，草履蟲的存活個(gè)數(shù)越多，種群密度越大.說明在一定濃度范圍內(nèi)，吡蟲啉和養(yǎng)樂果對(duì)草履蟲的生長和種群的繁殖具有促進(jìn)作用.這一現(xiàn)象與內(nèi)分泌干擾物[11]效應(yīng)相類似.

內(nèi)分泌干擾物是指在環(huán)境中存在著干擾人類和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)功能并產(chǎn)生不利影響的物質(zhì).一般通過攝入、積累等途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)生物體的生長、繁殖、代謝等功能具有嚴(yán)重危害[12].近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)內(nèi)分泌干擾物對(duì)生物體的影響做了許多研究，但多以高等動(dòng)物作為研究對(duì)象，而對(duì)單細(xì)胞動(dòng)物的研究卻較少.Chantana等[13]和 Padungtod等[14]都研究了內(nèi)分泌干擾物對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)造成的影響.同時(shí)胡好遠(yuǎn)等[15]探究得出鎘對(duì)單細(xì)胞草履蟲種群密度的增長具有促進(jìn)作用，因此猜測這種影響的產(chǎn)生是因?yàn)殒k具有內(nèi)分泌干擾物效應(yīng).但是對(duì)于養(yǎng)樂果和吡蟲啉是否也具有內(nèi)分泌干擾物的作用還有待進(jìn)一步研究.

本實(shí)驗(yàn)中，高效氯氟氰菊酯對(duì)草履蟲的48 h慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與養(yǎng)樂果和吡蟲啉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有明顯區(qū)別.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示: 在濃度為0.20～20.00 mg/L 范圍內(nèi)，高效氯氟氰菊酯的濃度越高，草履蟲的存活數(shù)量越多，種群密度越高，即在一定濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)草履蟲的種群密度隨濃度的增大而增大的現(xiàn)象.這種現(xiàn)象與環(huán)境雌激素效應(yīng)[16-17]相類似.外國學(xué)者Snell[18]和Radix等[19]首次研究證明，當(dāng)水體具有雌激素活性的污染物后，會(huì)影響輪蟲的生長繁衍.王莉霞等[20]探究了氰戊菊酯在單細(xì)胞動(dòng)物中的影響，得出氰戊菊酯可能具有一定的雌激素效應(yīng).但高效氯氟氰菊酯是否也具有環(huán)境雌激素效應(yīng)還有待更深入的探討.