孫文霞， 陳 勇(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052)

0 引 言

伏格列波糖，化學(xué)名為(+)-1L-[1(羥基),2,4,5/3]-5-[2-羥基-1-(羥甲基)乙基]氨基-1-碳-(羥甲基)-1,2,3,4-環(huán)已四醇，是一種從放線菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的天然糖類似物，能夠抑制小腸壁細(xì)胞a-葡萄糖苷酶的活性，從而有效改善糖尿病餐后血糖，目前廣泛用于I、II型糖尿病的防治[1-5].2006年，伏格列波糖口腔速溶膜劑面世，并得到廣泛使用，但目前關(guān)于控制其質(zhì)量的相關(guān)文獻(xiàn)較少.對(duì)此，本研究通過(guò)建立柱后衍生HPLC熒光檢測(cè)法，測(cè)定伏格列波糖口腔速溶膜中伏格列波糖的含量和有關(guān)物質(zhì)，以有效控制伏格列波糖口腔速溶膜劑的質(zhì)量.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：伏格列波糖對(duì)照品(批號(hào)，100826-200801，純度99.2%)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；伏格列波糖口腔速溶膜(批號(hào)，140711、140712、140713，規(guī)格為0.2 mg)，由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；伏格列波糖口腔速溶膜(批號(hào)，4C11W，規(guī)格為0.2 mg)，購(gòu)自日本救急藥品工業(yè)株式會(huì)社；乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)fisher公司；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：LC-20AB型高效液相色譜儀、RF-10AXL型熒光檢測(cè)器、CRB-6A型化學(xué)反應(yīng)箱、LC-Solution色譜工作站(日本島津公司)；FE-20型pH計(jì)(梅特勒—托利多公司)；CPA-225D型十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司).

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：含量測(cè)定用色譜柱為COSMOSIL 5C18-PAQ柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；有關(guān)物質(zhì)測(cè)定用色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；含量測(cè)定流動(dòng)相為0.045%辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液(取3.12 g磷酸二氫鈉二水合物，加水1 000 mL使其溶解，用磷酸調(diào)pH值至3.5)—甲醇(94∶6)；有關(guān)物質(zhì)測(cè)定流動(dòng)相為磷酸緩沖液(取1.56 g磷酸二氫鈉二水合物溶解于500 mL水中，另取3.58 g十二水磷酸氫二鈉溶解于500 mL水中，用磷酸調(diào)pH值至6.5， 將2種溶液混合均勻)—乙腈(37∶63)；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm；柱溫為25 ℃；熒光衍生試劑的制備方法為，取?；撬?.25 g、高碘酸鈉2.56 g溶解至1 000 mL水中，搖勻，即得；反應(yīng)浴溫度為100 ℃，聚四氟乙烯反應(yīng)管長(zhǎng)20 m(內(nèi)徑0.5 mm)，冷卻浴溫度為15 ℃，聚四氟乙烯冷卻管長(zhǎng)2 m(內(nèi)徑0.3 mm)；流動(dòng)相與熒光試劑流速相同，含量測(cè)定為1.0 mL/min，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定為0.6 mL/min；進(jìn)樣量100 μL.

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液配制.

取本品10片，剪碎，置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相40 mL，超聲處理10 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為含量測(cè)定用供試品液.另取本品10片，剪碎，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相4 mL，超聲處理10 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為有關(guān)物質(zhì)檢查用供試品溶液.

2.2.2 對(duì)照品溶液配制.

精密稱取伏格列波糖對(duì)照品10 mg，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液.

2.2.3 對(duì)照溶液配制.

精密量取1.0 mL“2.2.1”項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查用供試品溶液，置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)檢查用對(duì)照溶液.

2.3 含量測(cè)定

精密量取“2.2”項(xiàng)下含量測(cè)定用供試品溶液和對(duì)照品溶液各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.按外標(biāo)法計(jì)算出供試品中伏格列波糖的含量.

2.4 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照溶液100 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%.再精密量取“2.2”項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查用供試品溶液100 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2.5倍.供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，扣除輔料峰后，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液峰面積的0.2倍(0.2%)，各個(gè)雜質(zhì)峰面積之和不得大于對(duì)照溶液峰面積的0.5倍(0.5%).

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 專屬性.

取本品適量(批號(hào)140711，約相當(dāng)于伏格列波糖2.0 mg)，置于5 mL的容量瓶中，平行制備6份，進(jìn)行破壞性實(shí)驗(yàn)，具體包括：

1)高溫破壞.樣品經(jīng)100 ℃高溫加熱約4 h；

2)光照破壞.樣品在光照度為(4 500±500) lx下放置10 d.

3)氧化破壞.樣品加30%雙氧水0.5 mL，放置1 h.

4)酸破壞.樣品中加1 mol/L的鹽酸0.5 mL，放置4 h后，用1 mol/L的氫氧化鈉至中性.

5)堿破壞.樣品加1 mol/L的NaOH溶液0.5 mL，放置4 h，加1 mol/L 的HCl溶液至中性.

上述經(jīng)破壞的樣品均用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果顯示：本品經(jīng)光照和高溫破壞，主峰面積有所下降，雜質(zhì)個(gè)數(shù)和峰面積均有所增加；在經(jīng)酸、堿和雙氧水破壞后主峰面積明顯降低，說(shuō)明該藥對(duì)酸、堿和雙氧水不穩(wěn)定.相鄰雜質(zhì)與主成分色譜峰分離較好，分離度大于1.5，說(shuō)明所建方法的專屬性強(qiáng).破壞性實(shí)驗(yàn)色譜如圖1所示.

圖1 破壞性實(shí)驗(yàn)色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系.

精密稱取伏格列波糖對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成每1 mL中含伏格列波糖25.0、32.0、40.0、45.0、50.0 μg的溶液，分別精密吸取100 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以峰面積Y對(duì)伏格列波糖X(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為，Y=243 345X-811 215.73(R=0.9999，n=5).結(jié)果表明，伏格列波糖濃度與色譜峰面積在25.0～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.5.3 進(jìn)樣精密度.

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和對(duì)照溶液各100 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)測(cè)定6次，峰面積的RSD分別為0.52%和0.76%.結(jié)果表明，儀器的進(jìn)樣精密度良好.

2.5.4 重復(fù)性.

取同一批樣品(批號(hào)，140711)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份含量測(cè)定用供試品液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，計(jì)算得到含量分別為100.23%、100.06%、100.35%、100.74%、101.45%和101.63%，RSD為0.65%(n=6).結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好.

2.5.5 中間精密度.

精密稱取樣品(批號(hào)，140711)，按照“2.2”項(xiàng)下的方法配制成含量測(cè)定用供試品溶液和對(duì)照品溶液，于不同日期，不同操作人員在不同儀器上按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，并按外標(biāo)法計(jì)算伏格列波糖口腔速溶膜的含量，其含量的RSD為0.77%(n=6).結(jié)果表明，中間精密度良好.

2.5.6 回收率.

取本品10片置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相80 mL，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制成濃度為0.02 mg/mL的供試品母液，精密量取該母液1 mL置10 mL容量瓶中，平行制備9份，分別加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液4 mL(80%)、5 mL(100%)、6 mL(120%)，用流動(dòng)相稀釋至刻度，每個(gè)濃度平行制備3份.按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示.

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.7 檢測(cè)限與定量限.

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)，測(cè)得伏格列波糖的檢測(cè)限和定量限分別為2 ng和10 ng.

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

取3批樣品，照“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 樣品含量和有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

由于伏格列波糖分子結(jié)構(gòu)中不含共軛基團(tuán)，無(wú)紫外吸收，因而無(wú)法采用HPLC-UV法.目前相關(guān)文獻(xiàn)中測(cè)定伏格列波糖的方法主要有HPLC-ELSD法[6]、HPLC-RID法[7]、離子色譜法[8]、柱前衍生化GC法[9]、柱后衍生HPLC熒光檢測(cè)法[10-14]以及高效液相色譜—質(zhì)譜法[15].伏格列波糖口腔速溶膜劑作為一種新的劑型，尚未有關(guān)于其有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道.對(duì)此，本研究參考日本藥典中伏格列波糖原料和伏格列波糖片劑的標(biāo)準(zhǔn)，采取柱后衍生HPLC熒光檢測(cè)法進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)與含量的測(cè)定.

在日本的藥典中，采用氨基丙基硅烷填料色譜柱進(jìn)行含量測(cè)定，考慮到該色譜柱用量較少，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的條件，參考國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，采用C18色譜柱.由于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行純水相流動(dòng)相時(shí)柱子使用壽命較短，故對(duì)流動(dòng)相條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)流動(dòng)相為0.045%辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液(取3.12 g磷酸二氫鈉二水合物，加水1 000 mL使溶解，用磷酸調(diào)pH值至3.5)—甲醇(94∶6)，伏格列波糖的保留時(shí)間以及對(duì)稱性較好，但是考慮到水相比例仍較高，因而選擇親水性很好的COSMOSIL 5C18-PAQ柱.此外，在日本的藥典中，伏格列波糖原料藥對(duì)3個(gè)已知雜質(zhì)即雜質(zhì)1、雜質(zhì)2及雜質(zhì)3分別進(jìn)行了限定.而文獻(xiàn)[16]的研究表明，該3個(gè)雜質(zhì)為原料藥合成工藝過(guò)程所引入，并非伏格列波糖降解雜質(zhì).結(jié)合本研究的破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其均未在相應(yīng)保留時(shí)間處產(chǎn)生雜質(zhì)峰，故本研究認(rèn)為可不對(duì)本品中3個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行限制.