魏玉嬌， 郭曉強(qiáng)， 楊淞瑞， 李小紅， 何源超， 何順東， 劉達(dá)玉(.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 6006；.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 6005)

0 引 言

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，收載于《中國藥典》2015年版中[1].研究表明，土茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等作用，臨床上用于治療濕熱淋濁、筋骨疼痛、頭痛等癥[2].落新婦苷是土茯苓中關(guān)鍵的活性成分和質(zhì)量控制指標(biāo)成分，為二氫黃酮醇苷類化合物，《藥典》中規(guī)定土茯苓按干燥品計(jì)算，落新婦苷含量不得少于0.45%[1，3].目前，對土茯苓中落新婦苷的提取方法有回流提取、微波提取和超聲提取等，其中，超聲提取相較于回流提取法耗時(shí)較少，相較于微波提取法更適合工業(yè)生產(chǎn)[4-5].本研究以土茯苓為原料，采用超聲法提取其中的落新婦苷，利用HPLC法測定提取液中落新婦苷的含量，并通過響應(yīng)面法來優(yōu)化從土茯苓中提取落新婦苷的工藝，擬為土茯苓的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：土茯苓中藥飲片(批號，18080279)，購自四川千方中藥股份有限公司；落新婦苷對照品(批號，14070401，純度≥99%)，購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

2 方 法

2.1 落新婦苷含量測定

2.1.1 樣品粉末的制備.

取一定的土茯苓飲片，稱重，干燥2 h后稱重.再粉碎，過4號篩(60目)，制得樣品粉末.

2.1.2 供試品溶液的制備.

精密稱取過篩后的樣品粉末10 g于具塞錐形瓶中，按照一定的料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間進(jìn)行超聲提取，然后過濾，合并濾液，濃縮，用無水乙醇定容至250 mL，制得供試品溶液，備用.

2.1.3 對照品溶液的制備.

精密稱取干燥至恒重的落新婦苷對照品0.0010 g、0.0030 g、0.0050 g、0.0070 g、0.0090 g于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相(甲醇—0.1%冰醋酸=35∶65)溶解并定容到10 mL，制成濃度分別為0.10 mg/mL、0.30 mg/mL、0.50 mg/mL、0.70 mg/mL、0.90 mg/mL的系列對照品溶液.

2.1.4 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱為SinoChrom ODS-BP 5 μm(4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相為甲醇—0.1%冰醋酸(35∶65，v/v)，流速1.0 mL/min，檢測波長291 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL.

分別取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行分析，落新婦苷和其他雜質(zhì)均可完全分離，峰形符合要求，結(jié)果如圖1和圖2所示.

圖1 落新婦苷對照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系.

分別精密吸取落新婦苷對照品溶液適量，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.0167 mg/mL、0.0500 mg/mL、0.0833 mg/mL、0.1167 mg/mL、0.1500 mg/mL的系列對照品溶液.吸取各對照品溶液10 μL，按“2.1.4"項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析.以質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得落新婦苷的回歸方程為，A=2×107C+102 934(R2=0.999).結(jié)果表明，落新婦苷在0.0167～0.1500 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.1.6 精密度.

分別精密吸取落新婦苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到落新婦苷的峰面積積分值，計(jì)算其RSD值為0.06%(n=6).結(jié)果表明，儀器精密度良好.

2.1.7 穩(wěn)定性.

精密吸取同一個(gè)供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h內(nèi)各進(jìn)樣10 μL，測定落新婦苷的峰面積積分值，計(jì)算其RSD為0.04%(n=6).結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取同一批次的樣品粉末共6份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測定落新婦苷的含量，計(jì)算其RSD為0.11%(n=6).結(jié)果表明，測定方法重復(fù)性良好.

2.1.9 回收率.

精密量取已知落新婦苷濃度的樣品溶液2 mL，共5份，每份分別精密加入落新婦苷對照品溶液各100 μL(共0.2 mg)，用流動(dòng)相定容制備成供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算落新婦苷的平均回收率為99.27%，RSD為1.10%，結(jié)果見表1.

表1 供試品中落新婦苷的平均回收率

2.2 單因素實(shí)驗(yàn).

2.2.1 乙醇濃度對落新婦苷含量的影響.

固定料液比為1∶20(g∶mL)，超聲波法提取落新婦苷，提取時(shí)間30 min，考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%、95%)對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值.

2.2.2 提取時(shí)間對落新婦苷含量的影響.

固定料液比為1∶20(g∶mL)，乙醇濃度為80%，超聲波法提取落新婦苷，考察提取時(shí)間(15、30、60、90、120 min)對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值.

2.2.3 料液比對落新婦苷含量的影響.

固定乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為90 min，超聲波法提取落新婦苷，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL))對土茯苓提取物中落新婦苷含量的影響，共做3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值[4].

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度(X1)，提取時(shí)間(X2)和料液比(X3)3個(gè)因素作為自變量，以土茯苓提取液中落新婦苷含量為因變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化土茯苓中落新婦苷的提取工藝，因素水平見表2.

表2 土茯苓中落新婦苷提取工藝的因素水平

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響.

乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響如圖3所示.

圖3 乙醇濃度對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖3可知，固定料液比和提取時(shí)間，隨著乙醇濃度的不斷增大土茯苓提取液中落新婦苷含量呈現(xiàn)先增加后降低之趨勢，乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)乙醇濃度大于80%時(shí)，落新婦苷含量下降明顯.故，初步確定提取溶劑乙醇濃度為80%.

3.1.2 料液比對提取液中落新婦苷含量的影響.

料液比對提取液中落新婦苷含量的影響如圖4所示.

圖4 料液比對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖4可知，固定乙醇濃度和提取時(shí)間，樣品粉末與提取液的比例為1∶10(g∶mL)時(shí)，落新婦苷的含量最高.故，初步確定提取料液比為1∶10(g∶mL).

3.1.3 提取時(shí)間對提取液中落新婦苷含量的影響.

提取時(shí)間對提取液中落新婦苷含量的影響如圖5所示.

圖5 提取時(shí)間對提取液中落新婦苷含量的影響

由圖5可知，固定乙醇濃度和料液比，隨著提取時(shí)間的不斷增大，落新婦苷含量也增大，當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，落新婦苷含量最高.故，初步確定提取時(shí)間為90 min.

3.2 響應(yīng)面法分析

3.2.1 回歸模型的建立和方差分析.

根據(jù)BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為研究因素，提取液中落新婦苷含量為響應(yīng)值.采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，方差分析見表4.

表3 土茯苓中落新婦苷提取工藝響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以提取液中落新婦苷含量為響應(yīng)值的線性回歸方程為，

Y=0.046+1.750E-003A+6.500E-003B-4.500E-003C+2.500E-004AB+5.750E-003AC-3.750E-003BC-0.016A2-0.016B2-9.125E-003C2(R2=0.951).

表4 土茯苓中落新婦苷提取工藝回歸分析結(jié)果

由表4可知，回歸模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明方程對實(shí)驗(yàn)的擬合程度較高，使用該方程模擬真實(shí)的三因素三水平分析是可行的，即本實(shí)驗(yàn)所得二次回歸方程與實(shí)際情況吻合度較好.A、C、AB、AC、C2對結(jié)果的影響表現(xiàn)為顯著(P<0.05)，各因素對土茯苓中落新婦苷提取工藝的影響大小依次為提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比.

3.2.2 響應(yīng)曲面分析.

為了進(jìn)一步研究變量之間的相互作用，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件模擬了各個(gè)因素對落新婦苷含量影響的3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果見圖6～圖8.

由6圖可知，響應(yīng)面曲線變化相對陡峭，等高線呈橢圓形，表明乙醇濃度和料液比的交互作用明顯，對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響也較為顯著.當(dāng)乙醇濃度與提取時(shí)間適當(dāng)增加時(shí)，落新婦苷的含量也隨之增大，且有穩(wěn)定的最大值.

由圖7可知，乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響明顯，等高線稀疏且呈橢圓形，而且弧度較大，說明兩因素的交互作用比較明顯.

由圖8可知，響應(yīng)曲面變化較平緩，等高線近似圓形，說明料液比和提取時(shí)間的交互作用不明顯，且對土茯苓提取液中落新婦苷含量的影響相對不顯著，隨著提取時(shí)間和乙醇濃度的同時(shí)增大，落新婦苷的含量呈先增大后降低的拋物線趨勢[6-8].

同時(shí)，本研究利用Design Expert 8.0.6軟件對回歸模型進(jìn)一步分析，得到土茯苓中落新婦苷提取工藝的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為67.7%，提取時(shí)間為87.5 min，料液比為1∶10.3(g∶mL)，在上述提取工藝條件下土茯苓提取液中落新婦苷的含量理論值為0.0621 mg/mL.

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應(yīng)面圖

圖7 乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應(yīng)面圖

圖8 提取時(shí)間和料液比交互作用對土茯苓提取液中落新婦苷影響的響應(yīng)面圖

3.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，同時(shí)考慮到實(shí)際情況和操作方便，修正后的優(yōu)化條件為：提取時(shí)間為90 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶10(g∶mL).進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，并將預(yù)測值與實(shí)測值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表5.

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，預(yù)測值與實(shí)測值之間的平均偏差為2.0%(<5%)，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，該提取工藝準(zhǔn)確可行.

4 結(jié) 論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓中落新婦苷提取工藝為：提取時(shí)間為87.5 min，乙醇濃度為67.7%，料液比為1∶10.3(g∶mL)，土茯苓提取液中落新婦苷含量的預(yù)測值為0.0621 mg/mL.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)測值與實(shí)測值之間的平均偏差為2.0%，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，該提取工藝準(zhǔn)確可行.根據(jù)優(yōu)化結(jié)果和實(shí)驗(yàn)操作條件，最終確定土茯苓中落新婦苷的提取工藝為：提取時(shí)間為90 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶10(g∶mL)，實(shí)驗(yàn)測定土茯苓提取液中落新婦苷平均含量為0.0611 mg/mL.本研究結(jié)論可為土茯苓的實(shí)際應(yīng)用與開發(fā)提供參考依據(jù).