邢亞楠，張 勇，黃嬌嬌，董煥聲，潘慶杰

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

對(duì)于母馬來說，繁殖特點(diǎn)為妊娠期長(zhǎng)，性成熟晚，體成熟晚,發(fā)情持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，以上因素決定了馬產(chǎn)業(yè)的周期長(zhǎng)、受胎率低。促進(jìn)母馬多排卵或者保證卵子質(zhì)量是保證高效率的繁殖方法。卵泡液是卵母細(xì)胞生存的微環(huán)境，卵母細(xì)胞成熟在卵泡液中可能涉及一些物種特異性機(jī)制，可能與馬卵泡液中所含的必需因子有關(guān)，已經(jīng)有報(bào)道在母馬中研究了一些可溶性因子[1]。

卵泡液(Follicular Fluid) 主要包括穿過血液卵泡屏障的血漿成分和從顆粒細(xì)胞分泌的物質(zhì)（如類固醇、氨基酸和其他核苷酸等），其為卵母細(xì)胞的成熟和隨后的發(fā)育提供了重要的生長(zhǎng)環(huán)境，也是卵母細(xì)胞與周圍細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換和能量代謝的場(chǎng)所，卵泡液代謝物組成和變化間接反映了卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及成熟過程[2]。因此，卵泡液的組成成分顯示了卵巢卵泡生長(zhǎng)的情況，這些物質(zhì)能更好地反映卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞質(zhì)量[3]。大量研究已經(jīng)檢測(cè)了卵泡液中特定激素和生長(zhǎng)因子的水平，并且已經(jīng)使用HPLC 技術(shù)在人類[4]和動(dòng)物[5]中鑒定了卵泡液中的氨基酸成分。此外，還確定了卵泡液的離子成分[6-7]以及葡萄糖、乳酸鹽、尿素和脂質(zhì)的存在。但只有少數(shù)研究描述了卵巢周期中卵泡液成分的變化[8]。卵泡液成分的研究可能有助于理解卵泡分化和發(fā)育中涉及的機(jī)制，所有這些因素的存在與卵巢細(xì)胞的代謝活動(dòng)有關(guān)，并反映了卵泡的生理狀態(tài)。然而，卵巢功能受這些因素的影響仍然未知。本文借助卵泡液代謝組學(xué)，得到直徑不同的卵泡液差異代謝物，試從卵泡液代謝組學(xué)層面探索卵泡直徑相關(guān)性生殖功能的實(shí)質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇8 頭營(yíng)養(yǎng)中等、健康的圈養(yǎng)即墨母馬，年齡均為3～5 歲。在3—4 月發(fā)情季節(jié)，屠宰后取得卵巢。裝入有37℃預(yù)熱的生理鹽水和雙抗混合液的保溫瓶中并帶回實(shí)驗(yàn)室。從屠宰場(chǎng)送回到實(shí)驗(yàn)室大約3 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（Agilent）；低溫高速離心機(jī) (Eppendorf 5430R)；色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column 乙腈(Merck，1499230-935)；乙酸銨(Sigma，70221) ；PBS 緩沖液（Hyclone，pH=7.4）。

1.3 卵泡挑選和卵泡液的收集方法 先用75%酒精輕輕擦洗卵巢表面，避免污染，然后放入37℃含雙抗的生理鹽水中，用滅菌剪刀剪掉母馬卵巢周圍的結(jié)締組織，選擇外觀明亮、呈淡粉色且無黃體的健康卵巢，用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵泡直徑，淘汰形狀不規(guī)則或者有破裂的卵泡。在無菌試驗(yàn)中，用10 mL 的無菌注射器抽取卵泡液，按照實(shí)驗(yàn)需求的直徑分別吸到無菌15 mL 離心管中，在1 200 r/min 的離心力下離心5 min 后，吸取澄清的上清液，分成等分試樣放入凍存管中并放入超低溫冰箱-80℃冷凍，將第1 次吸出的上清卵泡液送去公司檢測(cè)差異代謝物，剩下的樣品冷凍保存，進(jìn)行下一步分析。

1.4 樣本信息 本實(shí)驗(yàn)選取8 匹母馬的健康卵巢，選取直徑為45～60 mm 的卵泡為一組（大卵泡組）；直徑為20～30 mm 的卵泡為一組（小卵泡組），樣本信息見表1。

表1 2 組間的大小卵泡直徑

1.5 樣品預(yù)處理和儀器校正 把等體積的甲醇和乙腈充分混合，再取樣品100 μL 后加入400 μL 的甲醇-乙腈混合液中，渦旋混合均勻，在-20℃下放置60 min；在4℃溫度下，14 000 ×g 水平離心20 min，提取上清液，管底的沉淀物質(zhì)棄去；樣品預(yù)處理步驟完成后，在放入高效液相質(zhì)譜儀器分析前，對(duì)儀器進(jìn)行校正。用移液槍吸取乙腈和水各100 μL，然后充分混勻，在4℃下14 000 ×g 水平離心15 min 后，小心抽取上清混合液放入色譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 液相色譜分析方法 液相：Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（Agilent）；色譜柱：Waters,ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,2.1 mm×100 mm column；柱溫：25℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：正離子、負(fù)離子模式下都是2 μL；流動(dòng)相：水+25 mol/L乙酸銨+25 mmol/L 氨（A）水，乙腈（B）；梯度：梯度洗脫程序見表2。

表2 超高效液相色譜儀的濃度洗脫梯度表

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 用高效液相色譜本身自帶的處理軟件Data Analysis 進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，對(duì)圖譜峰進(jìn)行校正。用Proteo Wizard 軟件將校正數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML 格式。應(yīng)用軟件SIMCA-P14.1（Umetrics，Umea，Sweden）將具有相似特征的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，然后再使用降維法進(jìn)行檢驗(yàn)，主要是采用主成分分析數(shù)據(jù)處理。單維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法包括t-test 檢測(cè)和變異倍數(shù)解析，應(yīng)用R 軟件繪制圖譜。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 為避免儀器檢測(cè)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，對(duì)樣本采用隨機(jī)順序進(jìn)行研究。樣本混合中插入QC 樣品，用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)儀器的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。采用QC 樣本譜圖比對(duì)和PCA 分析對(duì)本項(xiàng)目的系統(tǒng)穩(wěn)定性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。將QC 樣本UHPLC-Q-TOFMS 總離子流圖，進(jìn)行譜圖重疊比較，結(jié)果表明各色譜峰的峰度和保留的時(shí)間基本重疊一致，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中由儀器引起的誤差較小（圖1）。

圖1 QC 樣品正（A）、負(fù)離子（B）模式TIC 重疊圖譜

圖2 正(A)、負(fù)(B)離子模式下大、小卵泡液得分圖

2.2 正、負(fù)離子模式下大、小卵泡液PCA 得分圖 PCA得分圖顯示，正離子模式下的大、小卵泡組在PC1 維度上沒有很好分離，并且大、小卵泡的個(gè)體分離非常大（圖2-A）；負(fù)離子模式下的大、小卵泡2 組在PC1 維度上有較好分離，且相對(duì)于大卵泡樣本，小卵泡樣本聚合的程度較好，大卵泡的分散程度太高（圖2-B）。

2.3 高效液相色譜下大、小卵泡液代謝物的差異 表3顯示，來自16 個(gè)卵泡（大小卵泡各8 個(gè)）和所研究的相匹配的定性定量代謝物，鑒于卵泡液是復(fù)雜的生物流體，可以看到一些類固醇激素、脂質(zhì)和糖類等。

表3 差異物質(zhì)

2.4 大、小卵泡液代謝物的比較 高效液相色譜定性定量測(cè)量對(duì)應(yīng)于上調(diào)代謝物睪酮、1-棕櫚酰溶血磷脂酸、β-硫酸雌醇、硫酸雌酮，下調(diào)物硫酸吲哚酚、木子塘、水蘇糖和3-脲基丙酸酯。如表3 所示，大卵泡中β-硫酸雌醇、硫酸雌酮含量較小卵泡高（FC=4.48,P＜0.05，F(xiàn)C=12.30,P＜0.05），大卵泡硫酸吲哚酚和3-脲基丙酸酯含量較小卵泡低（FC=0.70,P＜0.05，F(xiàn)C=0.54,P＜0.05）。

3 討 論

3.1 上調(diào)代謝物對(duì)卵泡發(fā)育的影響 本研究表明，在上調(diào)的4 種代謝物中，睪酮、β-硫酸雌醇和硫酸雌酮是類固醇激素，1-棕櫚酰溶血磷脂酸是磷脂酸，而這4 種代謝物在母馬大卵泡中含量高。1-棕櫚酰溶血磷脂酸參與生物體內(nèi)許多重要的生理活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞因子的分泌等[9-11]。本研究中，溶血性磷酸酯在大卵泡中含量高，說明此物質(zhì)對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育有影響，與Bettegowda 等[12]研究得出的溶血性磷酸酯可以改善卵母細(xì)胞功能的結(jié)論一致。

眾所周知，性激素對(duì)于女性的生殖發(fā)育來說非常重要，雄烯二酮和硫酸雌酮都是合成雌激素的前體[13-14]，雌二醇通過促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)而促進(jìn)卵泡發(fā)育[15-16]。大卵泡中雄烯二酮、硫酸雌酮和硫酸雌醇濃度最高，但在小卵泡中，類固醇激素都是下調(diào)的，由此可以推斷，類固醇激素是調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵物質(zhì)。

3.2 下調(diào)代謝物對(duì)卵泡發(fā)育的影響 下調(diào)的4 種代謝物包含木子塘、水蘇糖、3-脲基丙酸酯和硫酸吲哚酚，硫酸吲哚酚是一種蛋白質(zhì)類毒素，木子塘和水蘇糖都屬于糖類，3-脲基丙酸酯是一種核苷酸類代謝物，而這4 種代謝物在母馬大卵泡中含量低。本研究中，隨著卵泡直徑的不斷增大，卵泡內(nèi)糖含量減少，并且大卵泡內(nèi)糖含量大約是小卵泡的1/3，這一結(jié)果與Gérard 等[17]在母馬實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)論一致，即在母體的排卵前成熟過程中卵泡內(nèi)含糖量降低?？紤]到大、小卵泡直徑相差比較大，可以認(rèn)為這種卵泡內(nèi)葡萄糖的消耗是由進(jìn)入卵泡中的水稀釋造成的?；蛘咭部梢哉J(rèn)為，大卵泡由于一些生理問題或外界因素（即將要閉鎖），次級(jí)卵泡需要更多的能量發(fā)育成為優(yōu)勢(shì)卵泡。

有關(guān)研究證明，棉子塘和水蘇糖降低了豬對(duì)飼糧氮和氨基酸的消化率，說明水蘇糖和棉子糖的抗?fàn)I養(yǎng)性主要表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率上[18]。以上研究結(jié)果都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，進(jìn)一步解釋了可能在母馬中大卵泡液里糖類含量少的原因。在小卵泡中3-脲基丙酸酯濃度較高，鑒于3-脲基丙酸酯會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的積累，推測(cè)此物質(zhì)會(huì)抑制小卵泡繼續(xù)發(fā)育，通過抑制能量代謝來間接控制卵母細(xì)胞成熟發(fā)育[19]。硫酸吲哚酚多與腎病相關(guān)[20]，當(dāng)硫酸吲哚酚在正常人腎臟體內(nèi)聚集，不能被及時(shí)排出，就會(huì)與蛋白結(jié)合形成蛋白毒素[21]。硫酸吲哚酚具有很多毒性，如加速腎臟硬化[22]、促進(jìn)腎臟間纖維化[23]；也有研究表明硫酸吲哚酚與心血管疾病有關(guān)[24]。小卵泡中的硫酸吲哚酚含量高，有可能會(huì)從腎臟中滲透入卵泡液中，間接抑制了卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，也有可能是由于實(shí)驗(yàn)樣本少，且會(huì)出現(xiàn)疾病母馬。

本研究中，卵泡液中上調(diào)的物質(zhì)涉及到3 種常見的類固醇激素和1 種磷脂，都有利于卵泡發(fā)育，進(jìn)而間接促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟；而小卵泡中的代謝物對(duì)于卵母細(xì)胞基本上都是有抑制作用或毒害作用，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)的差異性代謝物與馬的生殖功能密切相關(guān)，影響馬卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、衰老，通過數(shù)據(jù)庫(kù)查找卵泡差異代謝物的生物學(xué)功能及其參與的相關(guān)代謝通路，對(duì)馬的大小卵泡中代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一些馬卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟或與其相關(guān)的代謝物，為今后提高馬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率提供了依據(jù)。但研究大小卵泡的篩選標(biāo)準(zhǔn)缺乏客觀的觀察指標(biāo)，而且由于卵泡液檢測(cè)費(fèi)用較高，獲取的樣本量少，缺乏大樣本、多中心的研究，需要進(jìn)一步研究。此外，本研究所篩選的差異性代謝物只是初步的篩選，代謝物具體的影響機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)中無法做到單卵泡單針取卵，混合后的卵泡液是否會(huì)影響結(jié)果不得而知，仍需進(jìn)一步探索新的方法，以提供全面可靠的依據(jù)。