李 君 ，梁文雙，赫秋亞，楊芳慧，權(quán) 凱，王笑笑，鄧紅雨*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南省反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料資源開發(fā)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

羊乳中總脂肪含量高且脂肪酸種類豐富，其短鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和共軛酸等含量均顯著高于牛奶。脂肪含量及脂肪酸組成是影響羊乳風(fēng)味的主要原因，因此，深入了解奶山羊乳腺乳脂代謝調(diào)控機(jī)制對(duì)改善羊乳品質(zhì)具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent Information Regulator 1，SIRT1）是 一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白脫乙酰酶，且SIRT1 是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵上游調(diào)控因子。在機(jī)體內(nèi)，SIRT1 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性是通過去乙酰化作用實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而調(diào)控眾多基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝及細(xì)胞衰老[1]。研究表明，SIRT1 通過去乙?；饔谜{(diào)節(jié)叉頭蛋白O1（Fork Head Box O 1，F(xiàn)oxO1）轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ，PPARγ）轉(zhuǎn)錄因子的活性[2-3]。PPARγ作為成脂分化因子，可促進(jìn)脂肪酸合成，加快脂肪沉積的速度。SIRT1 的激活劑白藜蘆醇（RES）是一種多酚類物質(zhì)，可以促進(jìn)SIRT1 表達(dá)，增強(qiáng)其酶活性，并抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（Sterol Regulatory Element Binding Protein 1，SREBP1）下游基因的表達(dá)[4]。肌肉中SIRT1 不僅通過去乙?；饔脕韰⑴c細(xì)胞糖脂代謝，也可通過去乙?；せ頟GC-1α的活性，增強(qiáng)PGC-1α的表達(dá)水平，從而加快線粒體中脂肪酸的氧化速度[5]。由此可見，SIRT1/FoxO1 參與調(diào)控脂質(zhì)代謝。PPARγ和SREBP1 是經(jīng)證實(shí)的奶山羊乳腺乳脂合成關(guān)鍵調(diào)控因子[6-7]。因此，研究SIRT1/FoxO1 激活對(duì)下游乳脂合成基因表達(dá)變化和調(diào)控機(jī)制可以進(jìn)一步完善奶山羊乳腺泌乳分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用SIRT1 激動(dòng)劑RES 處理奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，SIRT1/FoxO1 激活后檢測(cè)乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及甘油三酯（TG）含量，觀察細(xì)胞中脂滴積累情況，為進(jìn)一步研究該基因在泌乳過程中脂質(zhì)代謝的調(diào)控奠定基礎(chǔ)，為改善羊奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RES、油紅O、氫化可的松、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、催乳素和牛血清白蛋白（BSA）均購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone 公司；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司；組織細(xì)胞甘油三酯酶法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)奶山羊研究室饋贈(zèng)，采用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、10 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子、5 μg/mL 氫 化可得松和5 μg/mL 胰島素 的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于12 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí)，分別添加含有 0（對(duì)照）、50、100、150 μmol/L 的 RES 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而確定最佳的處理濃度。

1.3 細(xì)胞總RNA 的提取與cDNA 的合成 SIRT1 激動(dòng)劑處理48 h 后，收集細(xì)胞，采用北京天根生化科技有限公司細(xì)胞/ 組織總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照說明書進(jìn)行操作。RNA 樣品用紫外分光光度計(jì)（NANODROP 2000）測(cè)定RNA 樣品A260/A280吸收比率值，檢測(cè)濃度及純度合格后，以提取的RNA為模板，按照TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，將所有檢測(cè)合格的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 乳脂合成基因及內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量引物見表1，根據(jù)GenBank 已公布的山羊基因序列，利用Primer Premier 5.0 和Oligo 6 軟件分別設(shè)計(jì)特異實(shí)時(shí)熒光定量引物，采用跨內(nèi)含子的方法，每對(duì)定量引物的上、下游引物分布在不同的外顯子上，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約200 bp，各引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH和UXT基因作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR Premix ExTaqMix 10.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，上、下游 引物（10 μmol/ L ）各0.8 μL，加RNase free H2O 補(bǔ)足體系。于ABI 7500 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線。采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；△△Ct=△Ct試驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)定量引物序列

1.5 TG 含量測(cè)定 最適濃度的RES 處理奶山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h，用0.25%胰蛋白酶/EDTA 混合液消化并收集細(xì)胞沉淀，用PBS 清洗沉淀2 遍，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，每管加入200 μL PBS 后將細(xì)胞超聲破碎，按照細(xì)胞甘油三酯酶法檢測(cè)試劑盒給出的操作方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG 含量，取適量裂解液70℃水浴加熱10 min，室溫下2 000 r/min 離心 5 min，保留上清用于酶學(xué)測(cè)定，將10 μL 上清液與190 μL 工作液37℃反應(yīng) 10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（OD550nm）[6]。

1.6 油紅O 染色 細(xì)胞用激動(dòng)劑RES 處理48 h 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 遍；10% 中性甲醛加入到培養(yǎng)板上，固定細(xì)胞45 min；每孔細(xì)胞加入1 mL 油紅O染色30 min；最后用PBS 清洗3 遍，于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)和One-Way ANOVA 進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 表示差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度RES 對(duì)SIRT1/ FoxO1 通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組相比，不同濃度的RES 處理均能使SIRT1基因的mRNA 表達(dá)量上升，其中最佳RES 處理濃度為100 μmol/L（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，100 μmol/L RES 處理組的FoxO1基因mRNA表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）。

由圖2 可見，RES 處理濃度為100 μmol/L 時(shí)，SREBP1的相對(duì)mRNA 表達(dá)量較對(duì)照組下降（P＜0.05）；PPARγ的表達(dá)量在RES 處理濃度為100 μmol/L 和150 μmol/L時(shí)均顯著下降（P＜0.05）。由此得出，RES 的最佳處理濃度為100 μmol/L。

2.2 SIRT1/FoxO1 激活后對(duì)乳代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響由圖3 可見，與對(duì)照組相比，SIRT1/FoxO1 通路激活后，脂肪酸合酶（FASN）和硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（SCD1）基因（P＜0.01）和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因（CD36）的mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）下降；而脂解相關(guān)基因激素敏感脂酶（HSL）（P＜0.01）和甘油三酯水解酶（ATGL）基因上調(diào)（P＜0.05）；乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP3）和超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶6（ELOVL6）基因則無(wú)顯著變化。

圖1 不同濃度RES 對(duì)SIRT1 和FoxO1 基因表達(dá)的影響

圖2 不同濃度RES 對(duì)SREBP1 和PPARγ 基因表達(dá)的影響

圖3 SIRT1/FoxO1 激活后對(duì)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 SIRT1/FoxO1 對(duì)細(xì)胞TG 含量的影響 如圖4 所示，SIRT1/FoxO1 通路激活后，RES 處理組細(xì)胞中TG 含量下降（P＜0.05）。

2.4 SIRT1/FoxO1 對(duì)細(xì)胞中脂滴積累的影響 由圖5 可見，與對(duì)照組相比，SIRT1 激活后細(xì)胞核周圍脂滴積累明顯減少，表明SIRT1基因抑制脂滴的積累。

圖4 SIRT1/FoxO1 激活對(duì)細(xì)胞中TG 含量的影響

圖5 SIRT1/FoxO1 激活對(duì)細(xì)胞中脂滴積累的影響

3 討 論

SIRT1 是調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵上游因子，關(guān)于SIRT1 的研究主要集中在肥胖等疾病方面，但也發(fā)現(xiàn)SIRT1 通過一系列信號(hào)通路發(fā)揮作用調(diào)控脂質(zhì)代謝基因表達(dá)[8]。SIRT1 通過去乙?；饔眉せ頕oxO1，而FoxO1 通過調(diào)節(jié)不同的靶基因發(fā)揮其功能，PPARγ是其中的一個(gè)重要靶基因，二者結(jié)合可抑制脂肪細(xì)胞的分化，而PPARγ本身是促進(jìn)脂肪沉積，說明FoxO1 抑制PPARγ的表達(dá)。因而，SIRT1/FoxO1 與脂肪代謝密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L RES 的處理濃度細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并且能夠上調(diào)SIRT1和FoxO1基因的mRNA 表達(dá)，從而確定奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的最佳處理濃度為100 μmol/L，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

在脂肪組織中的研究表明，SIRT1 可通過與核受體以及視黃酸受體協(xié)同抑制PPARγ，削弱其對(duì)脂質(zhì)合成的促進(jìn)作用[3]。利用RNAi 技術(shù)沉默小鼠前體脂肪細(xì)胞中的SIRT1基因以后，PPARγ轉(zhuǎn)錄因子活性發(fā)生改變[3]。在肝臟中發(fā)現(xiàn)，SIRT1 活化后上調(diào)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶表達(dá)，進(jìn)而抑制ACC和FASN表達(dá)，從而減少肝臟脂肪的沉積[9]。在奶山羊乳腺中，乳脂的合成主要包括脂肪酸從頭合成、TAG 生成和脂滴形成3 個(gè)階段，由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及功能基因協(xié)作完成，并與脂肪酸運(yùn)輸、脂肪酸氧化、脂解作用等相關(guān)[10]。研究表明，SREBP1和PPARγ是調(diào)控泌乳過程的關(guān)鍵因子，通過結(jié)合功能基因啟動(dòng)子上誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[11]。本研究中，SIRT1/FoxO1 激活后，SREBP1和PPARγ表達(dá)量下降，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)FASN表達(dá)量也隨之下降，推測(cè)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸從頭合成受阻，細(xì)胞內(nèi)短中鏈脂肪酸含量降低。本實(shí)驗(yàn)中，SIRT1/FoxO1 激活促進(jìn)脂解相關(guān)基因HSL和ATGL的表達(dá)，由于脂肪酸的從頭合成過程受阻，細(xì)胞內(nèi)脂滴合成原料生成受限，HSL和ATGL基因表達(dá)上調(diào)，通過脂解提供脂肪酸，有利于乳腺泌乳功能的維持。轉(zhuǎn)錄因子FoxO1 可被脫磷酸作用/脫乙酰作用調(diào)節(jié)，導(dǎo)致其核轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)脂解限速酶ATGL的轉(zhuǎn)錄，SIRT1 對(duì)脂類代謝的作用是建立在FoxO1 調(diào)節(jié)ATGL表達(dá)的基礎(chǔ)上[12]。在奶山羊乳腺細(xì)胞中，Yao 等[13]研究表明PPARγ調(diào)控SCD1基因的表達(dá)，通過結(jié)合在SCD1基因的啟動(dòng)子上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)中，由于SIRT1/FoxO1 的激活抑制了PPARγ表達(dá)，從而導(dǎo)致其靶基因SCD1表達(dá)下降?？梢?，SIRT1/FoxO1 通過調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn) 錄 因 子SREBP1和PPARγ進(jìn) 而 調(diào) 控SCD1、FASN和ATGL的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，SIRT1/FoxO1 激活后，ACC、FABP3和ELOVL6的表達(dá)沒有發(fā)生變化，具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

SIRT1 可通過一系列信號(hào)通路抑制轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和SREBP1的活性，而SIRT1 對(duì)PPARγ和SREBP1的抑制作用可減少脂質(zhì)的合成與沉積[12]。在培養(yǎng)的小鼠3T3-L1 脂肪細(xì)胞中，敲除SIRT1后，F(xiàn)oxO1的乙酰化和磷酸化水平提高，ATGL表達(dá)減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞中TG 的水解作用降低[12]。Picard 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠3T3-L1 成纖維細(xì)胞過表達(dá)SIRT1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂肪含量降低，而SIRT1的低量表達(dá)引起TG 增加。研究還發(fā)現(xiàn)，人類肝癌細(xì)胞 Hep G2 中莫納可林 K 通過激活SIRT1-AMPK 通路，使 FoxO1 產(chǎn)生脫磷酸和核轉(zhuǎn)運(yùn)作用，造成細(xì)胞內(nèi)脂肪含量降低[14]。SIRT1-AMPK 通路的激活通過對(duì)FoxO1 的脫磷酸作用/脫乙酰基作用來調(diào)節(jié)下游基因ATGL的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)動(dòng)物脂類分解代謝作用。本研究中，RES 激活SIRT1 后，奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中TG 含量降低，脂滴積累減少，結(jié)合乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果，推測(cè)其原因是SIRT1 激活后，使FoxO1 脫磷酸和核轉(zhuǎn)運(yùn)作用，抑制了脂肪沉積轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制了FASN的表達(dá)，促進(jìn)了脂解基因ATGL和HSL的表達(dá)，最終使細(xì)胞中TG 含量下降，脂滴積累減少。由此說明，SIRT1對(duì)SREBP1和PPARγ介導(dǎo)的乳脂肪生成途徑具有拮抗作用，SIRT1 通過對(duì)SREBP1和PPARγ的負(fù)調(diào)節(jié)作用抑制乳脂生成基因的表達(dá)，從而抑制乳脂肪的合成。

4 結(jié) 論

本研究中，最適宜濃度100 μmol/L RES 激活SIRT1/FoxO1 通路，抑制乳脂調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（SREBP1、PPARγ）和乳脂合成相關(guān)基因（FASN、CD36和SCD1）的表達(dá)，上調(diào)脂解基因（HSL和ATGL）的表達(dá)。SIRT1/FoxO1 通路激活后，細(xì)胞中TG 含量顯著降低，細(xì)胞中脂滴積累減少。表明SIRT1/FoxO1 負(fù)調(diào)控奶山羊乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)合成。