俸 云，趙 鑫，阮子蕓，沈朋雷，石德順，陸鳳花

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004）

卵母細(xì)胞體外成熟（in vitroMaturation，IVM）可以為動(dòng)物克隆、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)提供充足的卵源，盡管人們對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟體系進(jìn)行了大量研究，但卵母細(xì)胞的體外成熟效率仍然顯著低于體內(nèi)成熟。由于培養(yǎng)環(huán)境中氧含量存在差異，體外成熟的卵母細(xì)胞會(huì)承受更高的氧壓，從而導(dǎo)致活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）過(guò)量產(chǎn)生。當(dāng)ROS 的產(chǎn)生速度超過(guò)其清除速度時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物大分子的正常結(jié)構(gòu)，從而對(duì)體外成熟效率產(chǎn)生影響。

目前研究在體外成熟過(guò)程中普遍采用添加抗氧化劑來(lái)清除過(guò)量ROS。研究表明，通過(guò)使用褪黑素[1]、白藜蘆醇[2]等抗氧化物質(zhì)可以降低卵母細(xì)胞中的ROS 含量，提高后續(xù)胚胎的發(fā)育效率。鋅作為哺乳動(dòng)物必需的微量元素，在配子生成、胎兒發(fā)育等生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用[3]。同時(shí)，鋅還具有抗氧化功能。有研究表明，在培養(yǎng)液中補(bǔ)充適量的鋅可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的危害[4]。

盡管鋅在哺乳動(dòng)物正常生理活動(dòng)的調(diào)控過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，但其在牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究以牛卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)在體外成熟過(guò)程中添加不同濃度的硫酸鋅初步探究其對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟和抗氧化作用的影響，為提高牛卵母細(xì)胞IVM 效率提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 牛卵巢購(gòu)自南寧市肉聯(lián)廠屠宰場(chǎng)。卵巢在離體后迅速保存于37℃左右經(jīng)高壓滅菌的生理鹽水中，并在4 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室；牛冷凍精液（麥管冷凍，250 μL/管）購(gòu)買(mǎi)自南寧市品改站；卵泡液樣本取自直徑為2～6 mm 的健康牛卵泡，血液樣本采集自體況健康的成年雌性牛頸靜脈。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 除特殊說(shuō)明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。TCM199 粉末和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，TRIzol Reagent 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，微量反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion 和Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司；本試驗(yàn)所用液體由三蒸水配制，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后使用。

體視顯微鏡和熒光倒置顯微鏡購(gòu)買(mǎi)自日本Nikon 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州佳德凈化科技公司；培養(yǎng)箱和培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.3 牛卵泡液、頸靜脈血清和體外成熟液中鋅含量的測(cè)定 分別收集健康牛的卵泡液和頸靜脈血液各5 個(gè)樣品，經(jīng)12 000 r/min 離心10 min 后，取上清并使用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，保存于-20℃冰箱中。培養(yǎng)液樣本選取本實(shí)驗(yàn)室所使用的卵母細(xì)胞體外成熟液（9.5 g/L TCM 199+2.2 g/L NaHCO3+0.11 g/L 丙酮酸鈉+1.2 g/L Hepes+0.009 g/L EDTA+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L 鏈霉素）。所有樣本采集完畢后，盡快送至廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國(guó)）對(duì)樣品中的鋅元素含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 牛卵母細(xì)胞的收集和體外成熟 牛卵巢經(jīng)消毒清洗后，使用帶有12 號(hào)針頭的注射器抽取直徑為2～6 mm 的卵泡內(nèi)容物。在體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)完整均勻、具有完整卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte Complex，COCs），依次使用洗卵液（CCM：9.5 g/L TCM 199+0.9 g/L NaCl+1.2 g/L Hepes+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L 鏈霉素+0.4 g/L NaHCO3+2% 胎牛血清）、體外成熟液清洗后，移入含有不同濃度硫酸鋅（0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL）的體外成熟液中，置于38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟，24 h 后統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。

1.5 牛卵母細(xì)胞的體外受精和胚胎體外培養(yǎng) 牛卵母細(xì)胞經(jīng)24 h 的體外成熟后，使用移液槍輕輕吹打COCs使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，選取胞質(zhì)均勻且排出第一極體的卵母細(xì)胞，移入由受精液（F 液：TALP 基礎(chǔ)液+0.6%牛血清白蛋白+50 mg/L 肝素+2.5 mmol/L 咖啡因）制成的微滴中（每滴25 μL），用石蠟油覆蓋，每滴15個(gè)卵母細(xì)胞。37.5℃水浴解凍牛冷凍精液，將鏡檢合格的精液轉(zhuǎn)移至含2 mL F 液的圓管底部，置于培養(yǎng)箱中上游30 min，完成精子獲能。接著吸取上清，1 500 r/min離心5 min 后，棄上清，將約5 μL 高活力精子均勻加入到含有成熟卵母細(xì)胞的微滴中，調(diào)整密度為5×106個(gè)/mL左右，隨后置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中共孵育。

體外受精24 h 后，使用移液槍輕輕吹去黏附在合子表面的精子，使用胚胎培養(yǎng)液（CM：9.5 g/L TCM199+2.2 g/L NaHCO3+1.19 g/L Hepes+0.06 g/L 青霉素+0.1 g/L鏈霉素+3% 胎牛血清）清洗1 次后，移入由CM 制成的微滴中（每滴25 μL），并用石蠟油覆蓋，每滴15個(gè)早期胚胎，并置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隔天換液，并于受精完成后的24 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，144 h 后統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.6 缺鋅處理 參考前人的實(shí)驗(yàn)方法[5]對(duì)體外成熟液進(jìn)行缺鋅處理。使用10 μmol/L 鋅螯合劑N，N，N'，N'-tetrakis-（2-pyridylmethyl）-ethylenediamine（TPEN）來(lái)誘導(dǎo)缺鋅。將卵母細(xì)胞分為3 組：①常規(guī)體外成熟設(shè)為對(duì)照組；②10 μmol/L TPEN 處理；③10 μmol/L TPEN+10 μmol/L 硫酸鋅處理。隨后，通過(guò)使用10 μmol/L TPEN 處理不同時(shí)間（0、3、5、7 h）以檢測(cè)缺鋅時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。

1.7 卵母細(xì)胞cDNA 的合成 使用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS將體外成熟后的卵母細(xì)胞清洗3 次后，移入10 μL cell lysis Buffer 中裂解，每組20 個(gè)卵母細(xì)胞；置于PCR 儀中75℃孵育15 min 以滅活RNA 酶并釋放出卵母細(xì)胞中的基因組；之后加入1 μL DNase I 和10 μL 的10×reaction Buffer，37℃孵育30 min，用以消化基因組DNA；再加入1 μL EDTA，2 μL Random Primer，1 μL dNTP，65℃孵育10 min以滅活DNase I；最后加入10 IU Recombinant Rnase inhibitor，4 μL 5×First-Strand Buffer，2 μL dithiothreitol 和0.25 μL的SuperScripTM ⅡRT 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)程序：25℃，5 min；42℃，90 min；95℃，5 min；4℃，終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)所得cDNA 保存于-20℃冰箱中備用。

1.8 總RNA 提取和cDNA 第1 鏈的合成 應(yīng)用TRIzol法提取卵丘細(xì)胞的總RNA，對(duì)純度和完整性符合要求的RNA 立刻進(jìn)行cDNA 第1 鏈合成。反應(yīng)體系：混合2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser 和2 000 ng RNA 模板，再加入RNA-free H2O 補(bǔ)足 10 μL，置于PCR儀中42℃孵育2 min；隨后向上一步的混合液中加入4 μL 5×Primerscript Buffer，1 μL Primerscript Enzyme Mix，1 μL RT Primer Mix，最后加入RNA-free H2O；反應(yīng)程序：37℃，15 min；85℃，5 s。所得cDNA 存于-20℃冰箱中備用。

1.9 卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測(cè) 使用2'，7'-Dichloroflu orescin diacetate（DCHFDA）對(duì)體外成熟后卵母細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平進(jìn)行檢測(cè)，每組30 個(gè)卵母細(xì)胞。使用PBS將卵母細(xì)胞清洗3 次后，將卵母細(xì)胞移入含有10 μmol/L DCHFDA 的PBS 中，38.5℃避光孵育15 min，接著使用PBS 清洗3 次后置于熒光顯微鏡下觀察并使用軟件Image J 對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 根據(jù)NCBI 上已公布的引物序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物見(jiàn)表1。分別以卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞的cDNA 為模板，β-actin為內(nèi)參，使用相對(duì)定量的方法對(duì)基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，ROX Ⅱ 0.4 μL，上、下游引物（10 nmol/L）各0.3 μL，模 板cDNA 1 μL，RNA-free H2O 8 μL。反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃，30 s；55℃，1 min，共40 個(gè)循環(huán)。每次檢測(cè)重復(fù)3 次，并根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)差異。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，并應(yīng)用SPSS 17.0 軟件，使用單因素方差分析中的Tukey 檢驗(yàn)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

表1 RT-qPCR 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 牛卵泡液、頸靜脈血清和IVM 液中的鋅元素含量表2 結(jié)果表明，體外成熟液中鋅元素顯著低于牛卵泡液和頸靜脈血清。

表2 鋅元素含量的檢測(cè) μg/mL

2.2 缺鋅對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 表3 結(jié)果表明，使用鋅螯合劑TPEN 去除體外成熟液中的鋅元素后，卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著下降，而補(bǔ)充10 μmol/L 硫酸鋅后有所回升。表4 結(jié)果表明，缺鋅時(shí)間超過(guò)5 h，卵母細(xì)胞的第一極體排出率顯著下降，且具有時(shí)間依賴性。

表3 缺鋅對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表4 缺鋅時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.3 不同濃度硫酸鋅對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)發(fā)育的影響 表5 結(jié)果表明，各處理卵母細(xì)胞第一極體排出率無(wú)顯著差異。表6 結(jié)果表明，對(duì)添加硫酸鋅成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，各組間卵裂率無(wú)顯著差異；但與對(duì)照組相比，添加濃度為0.8 μg/mL 組的囊胚率顯著提高。

表5 不同濃度硫酸鋅對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表6 不同濃度鋅對(duì)牛胚胎體外發(fā)育的影響

2.4 鋅對(duì)成熟后卵母細(xì)胞中ROS 含量的影響 圖1 表明，與對(duì)照組相比，在體外成熟過(guò)程中添加0.8 μg/mL硫酸鋅可以下調(diào)卵母細(xì)胞中ROS 水平（P＜0.05）。

2.5 鋅對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響 圖2 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加0.8 μg/mL 硫酸鋅提高了成熟后的牛卵母細(xì)胞中抗氧化酶相關(guān)基因SOD1、CAT、TXN1和PRD1的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）。圖3 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0.8 μg/mL 硫酸鋅組卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX3和TSG6mRNA 的表達(dá)水平提高（P＜0.05），HAS2mRNA 的表達(dá)水平有所提高但差異不顯著。

圖1 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞ROS 水平

圖2 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)變化

圖3 添加0.8 μg/mL 硫酸鋅成熟后的牛卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展基因的表達(dá)變化

3 討 論

作為哺乳動(dòng)物必需的微量元素之一，鋅可以與蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等相互作用，對(duì)機(jī)體正常的生理活動(dòng)產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，體外成熟液中的鋅元素含量顯著低于體液，這很可能會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響。

為確定鋅元素是否會(huì)對(duì)牛卵母細(xì)胞的IVM 產(chǎn)生影響，本研究使用鋅螯合劑TPEN 去除體外成熟液中的鋅元素后進(jìn)行體外成熟，發(fā)現(xiàn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟效率顯著下降，且具有時(shí)間依賴性，而補(bǔ)充適量的硫酸鋅后成熟效率則出現(xiàn)了部分回升。這表明鋅參與了牛卵母細(xì)胞的體外成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)卵泡液中鋅元素含量會(huì)隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)而升高，并在排卵時(shí)達(dá)到最高[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，鋅在排卵前和排卵期會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟和顆粒細(xì)胞的功能，缺鋅會(huì)導(dǎo)致卵丘細(xì)胞分化、擴(kuò)張和卵泡破裂異常，并對(duì)卵母細(xì)胞體外和體內(nèi)的發(fā)育產(chǎn)生不良影響[7]。這些研究均表明，鋅在卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，極微量的鋅就能夠參與調(diào)控豬卵母細(xì)胞的第1 次減數(shù)分裂，保證卵母細(xì)胞完成核成熟[8]。而在本研究中，在體外成熟液中添加不同濃度硫酸鋅（0、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/mL）的各組間卵母細(xì)胞的第一極體排出率并無(wú)顯著差異。由于卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存了大量的蛋白質(zhì)、mRNA 和各種早期胚胎發(fā)育必需的微量元素，所以推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中各組卵母細(xì)胞第一極體排出率無(wú)顯著差異的主要原因很可能是牛卵母細(xì)胞中已經(jīng)儲(chǔ)存的鋅足夠用來(lái)調(diào)控減數(shù)第1 次分裂。為進(jìn)一步探討不同濃度硫酸鋅對(duì)牛卵母細(xì)胞IVM 質(zhì)量的影響，本研究對(duì)添加不同濃度的硫酸鋅成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精并統(tǒng)計(jì)早期胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各組胚胎卵裂率無(wú)顯著差異，但添加0.8 μg/mL 硫酸鋅組的囊胚率顯著提高。這表明在體外成熟過(guò)程中添加適量的鋅元素能夠提高卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量。另外，有研究報(bào)道，添加0.5 μg/mL和1.0 μg/mL 硫酸鋅能顯著提高牦牛早期胚胎的卵裂率，而添加2.0 μg/mL 硫酸鋅則能使牦牛的囊胚率顯著提高[9]。本研究的結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在差異，推測(cè)與卵母細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境以及物種差異有關(guān)。

作為抗氧化酶的組成成份之一，鋅元素含量很可能會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的氧化還原水平產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.8 μg/mL 硫酸鋅后進(jìn)行體外成熟，卵母細(xì)胞中ROS 含量顯著降低。由于ROS 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中可以通過(guò)改變氧化還原途徑而導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡及胚胎死亡[10]，推測(cè)在體外成熟液中添加適宜濃度硫酸鋅能降低ROS 含量，減少凋亡，促進(jìn)成熟質(zhì)量，進(jìn)而顯著提高牛體外受精胚胎的囊胚率。

抗氧化酶是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的代謝酶，可以去除超氧化物自由基并減少細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶Cu/Zn-SOD 活性位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)被擾亂，抗氧化能力減弱，從而誘發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[11]，而氧化應(yīng)激又是參與誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的一個(gè)主要機(jī)制[12]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)0.8 μg/mL 硫酸鋅處理后，卵母細(xì)胞中抗氧化酶基因SOD1、CAT、TXN1和PRD1的表達(dá)水平顯著提高，這表明在IVM 過(guò)程中添加硫酸鋅增強(qiáng)了卵母細(xì)胞的抗氧化能力。有研究也發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元細(xì)胞的體外培養(yǎng)基中添加鋅可以提高神經(jīng)元細(xì)胞中抗氧化酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育，并提高細(xì)胞的存活率[13]。

另外，作為在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一，卵丘細(xì)胞也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展程度能夠?qū)β涯讣?xì)胞的發(fā)育能力產(chǎn)生影響，從而影響卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量[14]。目前學(xué)界普遍將卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展水平視為評(píng)判卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的指標(biāo)之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟過(guò)程中添加硫酸鋅后卵丘細(xì)胞擴(kuò)展基因PTX3、TSG6的mRNA 的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，提高了卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵母體外成熟過(guò)程中添加0.8 μg/mL硫酸鋅可以提高卵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶基因和卵丘擴(kuò)展基因的表達(dá)水平，降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量和體外受精胚胎的發(fā)育效率。