張鳳環(huán)，上官文鋒，王學(xué)文，李廣平

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科，天津心血管病離子與分子機(jī)能重點實驗室，天津心臟病學(xué)研究所，天津300211）

心房顫動是臨床上最常見的快速性心律失常之一，其病理生理機(jī)制主要為心房重構(gòu)，其中腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，已證實Ang II有強(qiáng)的促心臟重構(gòu)作用[1]。而RAS系統(tǒng)中的另一成分，血管緊張素-（1-7）[Ang-（1-7）]可經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2/血管緊張素-（1-7）/Mas（ACE2/Ang-（1-7）/Mas）通路對抗Ang II而發(fā)揮降血壓、改善心臟重構(gòu)的作用，并在抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化中也起到作用。p38MAPK信號通路與心肌纖維化、心肌肥大、缺血再灌注損傷有關(guān)，但是p38MAPK信號通路是否參與了房顫的病理生理改變，以及Ang-（1-7）對于p38MAPK信號通路有無干預(yù)作用尚不明確。本研究擬探討房顫動物模型中心房重構(gòu)與p38MAPK蛋白激活的關(guān)系和Ang-(1-7)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備及材料 健康成年雜種犬購自天津醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心；特制犬高頻心房起搏器購自復(fù)旦大學(xué)電子工程系；TOP2001多導(dǎo)電生理儀購自上海宏桐有限公司；DF-5A型電生理刺激儀購自蘇州市東方電子儀器廠；Alzet?微量滲透泵購自美國DURECT公司；Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司；電泳轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能公司；Ang-（1-7）試劑購自Bachem公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體購自全式金公司；小鼠抗大鼠p38MAPK抗體、兔抗大鼠磷酸化p38MAPK抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購自Promega公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與模型建立 健康成年雜種犬15只，體質(zhì)量12Kg左右，雌雄不限，隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組（Sham，S組），心房起搏組（Pacing，P組）和心房起搏+Ang-（1-7）組（A 組），每組 5只。所有犬均以3%異戊巴比妥鈉30 mg/Kg麻醉，氣管插管連接呼吸機(jī)，仰臥位固定，監(jiān)測心電圖、血氧飽和度、動脈血壓，靜脈點滴5%葡萄糖生理鹽水注射液，分離右側(cè)頸外靜脈，穿刺頸外靜脈向近心端送入電極至右心房，電極遠(yuǎn)端連接電生理刺激儀，用500次/min快速起搏心房，當(dāng)記錄到1：1心房奪獲并起搏良好，固定電極，電極末端連接特制犬高頻心房起搏器，起搏電壓5 V，脈寬0.2 ms，頻率500次/min，起搏器埋置于肩胛間區(qū)皮下囊袋，術(shù)中嚴(yán)格無菌操作，術(shù)后應(yīng)用抗生素預(yù)防感染，S組起搏器不起搏，P組和A組連續(xù)起搏2周，A組同時皮下埋置Alzet?微量滲透泵，經(jīng)頸外靜脈給予Ang-（1-7）以6 μg/Kg/h持續(xù)泵入至實驗結(jié)束。

1.2.2 房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間測定 各組犬起搏2周后，3%異戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接呼吸機(jī)與體表心電圖，正中開胸，暴露心臟，將6對雙極記錄電極分別與高位左心房、低位左心房、左心耳、高位右心房、低位右心房、右心耳連接，將4對電極與左上、下肺靜脈和右上、下肺靜脈連接，各電極與多導(dǎo)電生理記錄儀連接，應(yīng)用心臟程序期前刺激法測量心房6點基礎(chǔ)起搏周長為250 ms時的心房有效不應(yīng)期，應(yīng)用快速刺激誘發(fā)房顫，測定各位點的房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間。

1.2.3 心房肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 電生理實驗結(jié)束后取出心臟，剪取心房肌組織，冷PBS洗凈血液后于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，分別進(jìn)行HE染色及Masson染色。

1.2.4 Western blot檢測心房肌組織p38MAPK、磷酸化p38MAPK的蛋白表達(dá)情況 電生理實驗結(jié)束后取出心臟，剪取左心房肌組織，冷PBS洗凈血液，置于凍存管中-80℃保存。剪取適量冷凍組織，液氮法研磨提取蛋白上清液，BCA法測定總蛋白濃度，等量上樣作SDS-PAGE電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別于稀釋 β-actin 抗體（1:5 000）、p38MAPK（1:1 000）抗體和磷酸化p38MAPK（1:1 000）抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，于相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法于化學(xué)發(fā)光呈像系統(tǒng)中曝光，使用Tanon Gis系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度分析計算凈光密度，以目的蛋白凈光密度/β-actin凈光密度的比值反應(yīng)目的蛋白相對水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS21進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析處理，計量資料用±s表示，多組樣本均數(shù)比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組犬起搏前后心室率比較 各組犬起搏前及起搏后心室率比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組犬起搏前后心室率比較Tab 1 Comparison of ventricular rate before and after pacing in each group

2.2 各組犬心臟超聲參數(shù)變化 快速心房起搏使P組犬左室射血分?jǐn)?shù)較S組明顯降低（P＜0.05），而A組與P組比較左室射血分?jǐn)?shù)提高（P＜0.05）且仍低于S組，但左房內(nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑、室間隔厚度及左室后壁厚度的變化在3組間未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組犬心臟超聲參數(shù)的變化Tab 2 Changes in cardiac ultrasound parameters in each group

LA左房內(nèi)徑，LVEDD左室舒張末期內(nèi)徑，LVEF左室射血分?jǐn)?shù)，IVS室間隔厚度，LVPW左室后壁厚度，a與S組比較P＜0.05，b與P組比較P＜0.05

2.3 各組犬心房有效不應(yīng)期、房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間的變化 與S組相比，P組各部位心房有效不應(yīng)期明顯縮短，而A組與P組比較在高位右房、高位左房和低位左房的心房有效不應(yīng)期延長；P組房顫誘發(fā)率升高，房顫持續(xù)時間延長，A組與P組比較房顫誘發(fā)率降低，房顫持續(xù)時間縮短，見表3、4。

表3 各組犬房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間Tab 3 AF inducibility and duration in each group

表4 各組犬不同部位心房有效不應(yīng)期(ms)Tab 4 AERP of each group(ms)

2.4 心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)學(xué)變化 HE、Masson染色可以觀察到P組較S組心房肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞大小不均，細(xì)胞間纖維組織增多，而Ang-（1-7）干預(yù)后可減輕上述變化，見圖1、2。

圖1 心房肌組織HE染色（200×）Fig 1 HE staining of atrial myocardium(200×)

圖2 心房肌組織Masson染色（200×）Fig 2 Masson staining of atrial myocardium(200×)

2.5 p38MAPK、磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)情況 與S組相比，P組磷酸化p38MAPK蛋白水平明顯升高（P＜0.05），使用 Ang-（1-7）干預(yù)后可使其降低（P＜0.05），但3組p38MAPK蛋白水平的變化未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，見表 5、圖 3。

表5 各組犬左心房各目的蛋白相對表達(dá)量平均值Tab 5 Relative expression levels of proteins in the left atrium of each group

圖3 Western blot檢測p38MAPK、磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)情況Fig 3 Western blot of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK protein expression

3 討論

心房顫動是臨床上常見的一種以心房快速、無序的電活動為特征的心律失常，其對人體的危害主要為血栓栓塞和心功能損害。房顫可使心衰的患病率增加3倍并且加重心衰的癥狀[2]，在本實驗中，兩周的快速心房起搏就可使左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低。房顫的病理生理改變主要包括心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房有效不應(yīng)期和動作電位時限縮短、動作電位傳導(dǎo)速度減慢、不應(yīng)期離散度增加等，結(jié)構(gòu)重構(gòu)則包括心房肌細(xì)胞退行性變和心肌間質(zhì)纖維化等[3]，在我們的前期實驗中已觀察到快速心房起搏可使心房肌細(xì)胞離子通道發(fā)生改變[4-5]，本實驗中通過快速心房起搏模擬房顫，兩周后關(guān)閉心房起搏器，雖然各組犬竇性心律時的心室率變化沒有意義，但是心房起搏組犬心房有效不應(yīng)期縮短，房顫誘發(fā)率及持續(xù)時間升高，心肌細(xì)胞間纖維組織明顯增多，符合房顫的病理生理改變，即房顫造模成功。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，在介導(dǎo)細(xì)胞生長、凋亡、炎癥及應(yīng)激反應(yīng)等起到十分重要的作用[6]，并與心肌纖維化、心肌肥大、缺血再灌注損傷有關(guān)[7-8]。p38MAPK通路也參與了房顫的發(fā)生和維持，如在兔肺靜脈肌袖中的研究發(fā)現(xiàn)，致房性心律失常作用主要通過激活p38MAPK信號通路[9]；與竇性心律相比，房顫患者心肌局部磷酸化p38MAPK水平明顯升高，據(jù)此認(rèn)為MAPK途徑的激活可能是心房纖維化的分子基礎(chǔ)[10]，p38MAPK還可通過干預(yù)炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)代謝、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原沉積等參與心肌纖維化[7]。在細(xì)胞水平已證明快速起搏可使心房肌細(xì)胞L型鈣通道α1c亞單位、Kv4.3表達(dá)下降，磷酸化p38MAPK升高，特異性阻斷p38MAPK可減輕這一變化[11]，即p38MAPK可能參與了電重構(gòu)，本研究在在體實驗水平也證實快速心房起搏所導(dǎo)致的心房重構(gòu)伴隨著p38MAPK磷酸化激活，而總p38MAPK水平并無差異，這可能因為外界刺激因素經(jīng)多級傳遞使磷酸化激酶活化進(jìn)而磷酸化激活p38MAPK蛋白成為有活性狀態(tài)，活化后的p38MAPK蛋白才能調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生從而發(fā)揮作用[6]。目前快速心房起搏與p38MAPK激活的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，但有研究表明β3腎上腺素能受體在其中起到橋梁的作用[12]。

RAS系統(tǒng)與心血管疾病密切相關(guān)，其中的重要效應(yīng)因子Ang II與AT1R結(jié)合可通過多種途徑調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞損傷、動脈硬化、心肌纖維化和炎癥反應(yīng)等[13]。Ang-（1-7）是 RAS 系統(tǒng)的另一活性物質(zhì)，與Ang II的生理作用相反，其可抑制并改善多種心血管疾病所導(dǎo)致的心肌肥大和纖維化[14]，并在抗炎癥反應(yīng)中起到作用，如抗白細(xì)胞募集、降低促炎因子表達(dá)、增加抗炎因子表達(dá)等[15]。在筆者的前期實驗中，使用Ang-（1-7）可以減輕快速心房起搏導(dǎo)致的離子通道改變，使電生理指標(biāo)明顯改善，也可通過降低ACE、ERK1/ERK2的表達(dá)，提高ACE2表達(dá)減輕心房肌纖維化[5,16-17]。Ang-（1-7）也可干預(yù) p38MAPK 通路，如Ang II可使人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯升高，細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）和MCP-1表達(dá)明顯升高，而Ang-（1-7）可通過Mas受體，減輕p38MAPK蛋白磷酸化水平從而逆轉(zhuǎn)這一變化[18]。在本實驗的房顫模型中，Ang-（1-7）可延長心房有效不應(yīng)期，降低房顫誘發(fā)率和持續(xù)時間，降低p38MAPK磷酸化激活，改善心肌纖維化，但這些作用是否經(jīng)Mas受體及是否直接作用于p38MAPK通路還未得知。

在本實驗中，通過快速右心房起搏建立房顫動物模型，可以觀察到心房重構(gòu)的表現(xiàn)，并且磷酸化p38MAPK蛋白水平顯著升高。磷酸化p38MAPK激活后可能通過介導(dǎo)下游的細(xì)胞因子的表達(dá)而觸發(fā)并加重心房重構(gòu)，從而導(dǎo)致房顫的發(fā)生和持續(xù)，而給予Ang-（1-7）干預(yù)后，心房重構(gòu)改善，心房磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明Ang-(1-7)可能通過抑制心房p38MAPK激活發(fā)揮其抑制心房重構(gòu)的作用。但是，心房重構(gòu)與p38MAPK激活的具體關(guān)系及Ang-（1-7）干預(yù)p38MAPK通路的具體機(jī)制目前尚不明確，需進(jìn)行深入研究。