閆靜波，衛(wèi)茹，劉登湘，劉曉麗，齊蕾，邱鵬

河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院1病理科，3放療科，4腫瘤內(nèi)科，河北 邢臺(tái)054031 2邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校微生物與免疫教研室，河北 邢臺(tái)054000

食管胃結(jié)合部腺癌（adenocarcinoma of esophagogastric junction，AEG）即食管胃連接線上下5 cm內(nèi)的腺癌，其預(yù)后較差，且發(fā)病率逐年上升[1]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種血管形成因子，能增強(qiáng)血管的通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。微血管密度（microvessel densitv，MVD）是新生微血管的重要指標(biāo)，CD105表達(dá)于組織的新生微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，較其他抗體（如CD31、CD34）在微血管中的表達(dá)更特異[3]。本研究對(duì)VEGF蛋白和MVD在AEG中的表達(dá)情況及相關(guān)性進(jìn)行分析，并對(duì)其與患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2006年6月至2016年6月邢臺(tái)市人民醫(yī)院收治的AEG患者。所有患者均未行放、化療。本研究共納入AEG患者158例，其中女性57例，男性101例；≥50歲92例，＜50歲66例；腫瘤直徑：≥4 cm 74例，＜4 cm 84例；分化程度：中低分化103例，高分化55例；Lauren分型：彌漫型及混合型性67例，腸型91例；浸潤深度：腫瘤浸潤肌層117例，腫瘤浸潤黏膜層41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移93例；Siewert分型：Ⅰ型8例，Ⅱ型79例，Ⅲ型71例。收集AEG患者的AEG組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織（距離腫瘤病灶邊緣5 cm的正常胃黏膜）各158例。另外，選取同期于邢臺(tái)市人民醫(yī)院行手術(shù)治療的130例上皮內(nèi)瘤變患者的胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組織，其中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變51例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變79例。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測及結(jié)果評(píng)價(jià)

采用免疫組織化學(xué)法檢測VEGF和MVD表達(dá)情況。取AEG組織、癌旁正常胃黏膜組織、低級(jí)別和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織，常規(guī)二甲苯對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟處理，采用梯度乙醇進(jìn)行脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加山羊血清進(jìn)行非特異性封閉，37℃孵育15 min。用濾紙吸去封閉液，滴加一抗放入濕盒，4℃孵育過夜；滴加二抗工作液，37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片進(jìn)而測定VEGF和MVD在組織中的表達(dá)情況。

VEGF蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、棕黃色或褐色表達(dá)。根據(jù)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占比例得分乘積≥2分為陽性，0～1分為陰性。所有標(biāo)本均經(jīng)1位病理副主任醫(yī)師診斷和1位病理主任醫(yī)師審核。

MVD陽性表達(dá)定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，呈棕褐色表達(dá)。MVD計(jì)算方法參照Weidner計(jì)數(shù)法[4]：陽性表達(dá)的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均計(jì)數(shù)為1個(gè)微血管，管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞、帶靜脈竇及較厚肌層的血管不計(jì)入微血管；先在100倍光鏡下掃視整個(gè)組織切片，選取5個(gè)微血管密度最高的區(qū)域，然后在400倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域著色的微血管數(shù)，取其平均值表示MVD值。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測蛋白表達(dá)情況

裂解液提取AEG組織、癌旁正常胃黏膜組織、低級(jí)別和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中的總蛋白，參照標(biāo)準(zhǔn)裂解蛋白曲線測定蛋白的相對(duì)表達(dá)量。取4組變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，把凝膠電泳內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入VEGF抗體4℃過夜，加入二抗工作液，室溫下?lián)u床中孵育2 h后，加入堿性磷酸酶顯色劑20 min。掃描儀掃描條帶的灰度，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以癌旁正常胃黏膜組織蛋白的光密度值為參考標(biāo)準(zhǔn)1，AEG組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中目的蛋白與癌旁正常胃黏膜組織蛋白光密度值的比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)；用Spearman法分析AEG患者組織中VEGF與MVD的相關(guān)性。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF陽性表達(dá)率和MVD值的比較

癌旁正常胃黏膜組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和AEG組織中VEGF陽性表達(dá)率和MVD水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，癌旁正常胃黏膜組織中VEGF陽性表達(dá)率和MVD水平均低于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和AEG組織；AEG組織中VEGF陽性表達(dá)率和MVD水平均高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中VEGF陽性表達(dá)情況及MVD值的比較

2.2 VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

癌旁正常胃黏膜組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和AEG組織中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，癌旁正常胃黏膜組織中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和AEG組織，AEG組織中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組織中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表2 不同組織中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與癌旁正常胃黏膜組織比較，P＜0.05；b與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P＜0.05；c與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P＜0.05

組織類型VEGF蛋白癌旁正常胃黏膜組織（n=158）低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織（n=51）高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織（n=79）AEG組織（n=158）F值P值1.00±0.15 3.82±0.58a 6.01±0.97a b 8.26±1.30a b c 1779.76＜0.01

2.3 AEG組織中VEGF表達(dá)情況、MVD值與AEG患者臨床特征的關(guān)系

中低分化、彌散型及混合型、浸潤肌層和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移AEG患者的AEG組織中VEGF陽性表達(dá)率分別高于高分化、腸型、浸潤黏膜層和無淋巴轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.013、5.721、6.330、5.971，P＜0.05）；中低分化、彌漫型及混合型、浸潤肌層和有淋巴轉(zhuǎn)移AEG患者的AEG組織中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于高分化、腸型、浸潤黏膜層和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.783、5.692、5.210、4.702，P＜0.05）；中低分化、浸潤肌層和有淋巴轉(zhuǎn)移AEG患者的AEG組織中MVD分別高于高分化、浸潤黏膜層和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.470、6.271、3.562，P＜0.05）。（表3）

2.4 AEG組織中VEGF與MVD的相關(guān)性分析

158例AEG患者的AEG組織中，VEGF表達(dá)陰性的MVD為（23.83±12.26），低于VEGF表達(dá)陽性的 MVD（51.17±16.76），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.815，P＜0.05）；AEG組織中VEGF的表達(dá)水平與MVD值呈正相關(guān)（r=0.491，P＜0.05）。

表3 不同臨床特征AEG患者的AEG組織中VEGF表達(dá)情況及MVD值

3 討論

食管胃交界部（esophagogastric junction，EGJ）指下段食管和賁門、上段胃連接處的解剖學(xué)部位。發(fā)生在EGJ的惡性腫瘤稱為食管胃結(jié)合部腫瘤，包括AEG及遠(yuǎn)端食管鱗狀細(xì)胞癌[1]。AEG指腫瘤中心位于EGJ上下5 cm范圍內(nèi)的腺癌，常用Siewert分型，分為3型：AEG SiewertⅠ型，通常發(fā)生于下段食管黏膜的腺癌，起源于Barrett食管，腫瘤中心位于EGJ上方1～5 cm的腺癌，能夠從上方向下方浸潤EGJ；AEG SiewertⅡ型，發(fā)生于EGJ或者賁門的黏膜腸化區(qū)，腫瘤位于EGJ上方1 cm至EGJ下方2 cm；AEG SiewertⅢ型腫瘤是位于EGJ下方2～5 cm的腺癌，可以從下方向上方浸潤EGJ或下段食管[1]。歐美國家Siewert 3種分型AEG發(fā)病率基本相同；亞洲國家AEG SiewertⅠ型發(fā)病率相對(duì)較低，AEG SiewertⅡ型和Ⅲ型發(fā)病率相對(duì)較高[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，胃竇癌在全球發(fā)病率下降，然而AEG發(fā)病率逐年上升且AEG預(yù)后差，5年生存率為8%～37%[6]。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移離不開新生微血管，新生微血管為腫瘤提供氧和營養(yǎng)，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)行代謝和增殖。新生微血管形成前，腫瘤缺乏營養(yǎng)和供氧，腫瘤灶較小，也無臨床癥狀；新生微血管形成后，腫瘤快速生長，轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[7]。MVD作為衡量新生微血管的重要參數(shù)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)MVD值增加時(shí)，腫瘤細(xì)胞易穿透血管壁，遷入血液進(jìn)行轉(zhuǎn)移[8-10]。因此，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中，MVD是獨(dú)立的臨床預(yù)后指標(biāo)[10]。

VEGF是作用最強(qiáng)的血管生成因子，能促進(jìn)微血管新生[2]。本研究結(jié)果顯示，AEG組織中VEGF與MVD的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。VEGF廣泛分布于各種組織的血管內(nèi)皮中，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加微血管的通透性和營養(yǎng)外滲，使腫瘤獲得更多的營養(yǎng)和供氧而加快生長，同時(shí)也增加了腫瘤細(xì)胞向循環(huán)系統(tǒng)侵襲的可能性；VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后，也促進(jìn)腫瘤生長，脫落的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管，加快腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果顯示，癌旁正常胃黏膜組織中VEGF陽性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量和MVD值均最低，AEG組織中VEGF陽性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量和MVD值均最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因而，VEGF和MVD表達(dá)在腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，尋找以VEGF和MVD為靶點(diǎn)的藥物將對(duì)腫瘤的治療提供新的方法，并具有現(xiàn)實(shí)意義。

不同臨床特征AEG患者的AEG組織中VEGF表達(dá)情況及MVD值的比較，中低分化、彌散型及混合型、浸潤肌層和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移AEG患者的AEG組織中VEGF表達(dá)情況分別高于高分化、腸型、浸潤黏膜層和無淋巴轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中低分化、浸潤肌層和有淋巴轉(zhuǎn)移AEG患者的AEG組織中MVD分別高于高分化、浸潤黏膜層和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明AEG組織中VEGF和MVD值表達(dá)升高，同時(shí)促使腫瘤進(jìn)行性生長，使腫瘤分化程度低，惡性程度增高。

綜上所述，VEGF及MVD表達(dá)與AEG發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究VEGF及MVD在AEG中的表達(dá)及其機(jī)制，可為治療AEG尋找新的有效方法。