趙然旭 魏英杰 李莉 王清峙 陸洋 徐紅宇 有一偉

[摘要] 目的 檢測(cè)烏龍茶提取物是否可作為電子染色劑取代醋酸雙氧鈾用于心肌淀粉樣變?nèi)旧?，并在染色過(guò)程當(dāng)中使用不同的染色方法，改進(jìn)制備方法，比較其安全性與高效性。 方法 收集中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院2017年1～12月臨床懷疑淀粉樣變性的病例共計(jì)40例，其中心肌組織經(jīng)病理學(xué)觀察和特殊染色呈陽(yáng)性者10例。利用樹(shù)脂812常規(guī)包埋和改進(jìn)后方法對(duì)心肌組織進(jìn)行制備，再在復(fù)染鉛與不復(fù)染鉛這兩種情況下對(duì)超薄切片樣品進(jìn)行兩種不同染色劑（3%醋酸雙氧鈾水溶液、0.5%烏龍茶提取物）和兩種不同染色方法（滴染法、切片盒染色法）的電子染色，然后在透射電子顯微鏡下觀察比較其不同之處。 結(jié)果 復(fù)染鉛的情況下，在透射電子顯微鏡下心肌中淀粉樣物質(zhì)，利用2種電子染色劑和改進(jìn)后的制備方法進(jìn)行染色的結(jié)果均較理想，切片背景干凈，對(duì)比度高，所獲圖像清晰。 結(jié)論 在觀察心肌淀粉樣變中，烏龍茶提取物配合切片盒染色與改進(jìn)后的制備方法，可以更加安全、快速地替代醋酸雙氧鈾進(jìn)行透射電子顯微鏡電子染色。

[關(guān)鍵詞] 烏龍茶提取物;醋酸雙氧鈾;心肌淀粉樣變;透射電子顯微鏡

[中圖分類號(hào)] R737.14 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）10（a）-0017-04

Electron staining of myocardial amyloidosis by different preparation methods and tea instead of uranium

ZHAO Ranxu1 ? WEI Yingjie1? ?LI Li2 ? WANG Qingzhi2 ? LU Yang2 ? XU Hongyu2 ? YOU Yiwei2

1.Department of Electron Microscopy Platform of National Key Laboratory of Cardiovascular Diseases， Chinese Academy of Medical Sciences ?Peking Union Medical College ?National Center for Cardiovascular Diseases ?Fuwai Hospital， Beijing ? 100037， China; 2.Department of Pathology， ?Chinese Academy of Medical Sciences ?Peking Union Medical College ?National Center for Cardiovascular Diseases ?Fuwai Hospital， Beijing ? 100037， China

[Abstract] Objective To test whether oolong tea extract can be used as an electronic stain instead of uranyl acetate （UA） for myocardial amyloidosis staining. In the process of staining， different staining methods were used and improve the preparation methods and compare their safety and efficiency. Methods A total of 40 cases of clinically suspected amyloidosis were collected from Fuwai Hospital of the Chinese Academy of Medical Sciences from January to December 2017， and 10 cases of cardiac tissue positive after pathological observation and special staining. The myocardial tissues were prepared by conventional encapsulation and improvement of resin 812， and then two kinds of different stains （3% uranyl acetate solution， 0.5% oolong tea extract） were applied to the ultrathin section samples under the conditions of counterstaining lead or not counterstaining lead， and two different staining methods （drip method， slice box staining） electronic staining， and then the differences were compared under a transmission electron microscope. Results Under the condition of repeated staining of lead， the results of staining of amyloid substance in myocardium with two kinds of electron staining agents and the improved preparation method were all satisfactory. The background of the slice was clean， the contrast was high and the obtained image was clear. Conclusion In the observation of myocardial amyloidosis， oolong tea extract with section box staining and the improved preparation method can more safely and quickly replace dioxide-uranium acetate for transmission electron microscope electron staining.

[Key words] Oolong tea extract; Uranyl acetate; Myocardial amyloidosis; Transmission electron microscopy

透射電子顯微鏡簡(jiǎn)稱透射電鏡，是醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的重要工具，在積累了一定的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)后[1]，研究者們逐漸開(kāi)始在人類心臟病組織中，使用透射電鏡技術(shù)對(duì)疾病超微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行觀察。例如心肌淀粉樣變性，一類包括遺傳性或獲得性的疾病[2-4]，主要特征是錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)呈淀粉樣沉積在心臟?，F(xiàn)在這類代謝性疾病在心臟疾病中很常見(jiàn)，目前，心肌活檢標(biāo)本的病理診斷多采用蘇木精-伊紅染色法輔以免疫組織化學(xué)的方法通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行，但仍有部分病例難以明確診斷，需采用電鏡進(jìn)行明確診斷。

20世紀(jì)50年代，華生首次將醋酸鈾用作電子顯微鏡染色劑[5-6]，此后它在電子顯微鏡染色中得到了廣泛的應(yīng)用。但長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，鈾對(duì)操作者健康的傷害，操作的繁瑣，儲(chǔ)存環(huán)境的要求之高以及廢液的處理不易等問(wèn)題都沒(méi)有得到很好的解決，因此試圖尋找一種染色方法取代醋酸鈾的染色。為了解決前面提到的問(wèn)題，一些研究者做了很多嘗試，Kajikawa等[7]使用單寧酸作為替代品，但使用單寧酸不能深入滲透到組織中，這個(gè)方法只能在薄片中使用。Tanaka（田中）和Nakamura（中村）[8]比較了四種電子染色方法，單寧酸染色、orcein染色、鈀氯化物染色劑和鐵蘇木精染色劑在超薄切片中的彈性纖維。結(jié)果提示單寧酸染色是最好的。2003年，Sato等[9]得出結(jié)果顯示烏龍茶提取物（OTE）染色方法在肺組織的觀察中優(yōu)于丹寧酸。幾年后，Carpentier等[10]改進(jìn)了這一方法，他們將這種方法結(jié)合到微波爐中觀察植物組織。OTE用作醋酸鈾的替代品已被用于某些領(lǐng)域，例如觀察動(dòng)物組織植物組織和微孢子蟲(chóng)。本研究使用了OTE[11-12]作為醋酸鈾的替代品，配合自制的染色器具，改進(jìn)了制備方法，安全、快速地用于心肌淀粉樣變當(dāng)中。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院2017年1～12月臨床懷疑淀粉樣變性的病例40例，其中男28例，年齡22～73歲，平均（51.55±11.02）歲;女性患者12例，年齡35～68歲，平均（56.09±10.55）歲。10例患者心肌組織經(jīng)病理學(xué)觀察和剛果紅染色呈陽(yáng)性，其中男8例，年齡37～73歲，平均（55.13±10.35）歲;女2例，年齡52～65歲，平均（58.50±9.19）歲。以上實(shí)驗(yàn)所取樣本通過(guò)了患者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 ?醋酸鈾粉末（批號(hào)：71-031，中國(guó)國(guó)藥試劑）;OTE粉末（批號(hào)：日本特許5199220號(hào)，日本日新公司）。

1.2.2 主要儀器 ?透射電子顯微鏡（型號(hào)：JEM 1010，日本電子）;CCD（型號(hào)：Gatan 830，美國(guó)Gatan公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備方法 ?將懷疑心肌淀粉樣變的組織分為兩組，一組經(jīng)過(guò)常規(guī)病理檢查，剛果紅染色陽(yáng)性者列入本研究。檢測(cè)后相對(duì)應(yīng)的另一組樣本，一種經(jīng)常規(guī)812樹(shù)脂包埋法制樣;另一種用改進(jìn)后的方法制備樣品。兩種方法制成的膠塊均進(jìn)行連續(xù)超薄切片，待染色用。

1.3.2 超薄切片染色方法 ?使用滴染法：培養(yǎng)皿中鋪平封口膜，然后用一次性針管均勻滴上10滴染液，并試用不同染色劑染色。過(guò)程中要不斷更換封口膜。①3%醋酸鈾染液染色15～20 min。②0.5%的烏龍茶提取物緩沖液（pH 7.4）（0.1 mol/L的PBS配置而成）染色20～30 min。染色后，超薄切片分別用蒸餾水進(jìn)行清洗，切片上水分稍干后把以上切片分成兩組：一組待用于直接觀察，一組進(jìn)行檸檬酸鉛的復(fù)染15～20 min后進(jìn)行觀察。

使用切片盒染色法：培養(yǎng)皿中灌注石蠟，在未干燥之前，用切片盒壓制出相符合的形狀，鑄成染色模具，然后把切片盒（北京中興百瑞技術(shù)有限公司）打孔，把待染切片依次，順序放入切片盒，進(jìn)行如上染色，最后進(jìn)行觀察。

1.4 電鏡觀察

所有切片均使用JEM 1010，在加速電壓80 kV下，用CCD進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡檢測(cè)結(jié)果

40例心肌組織染色后證實(shí)有淀粉樣物質(zhì)沉積者10例。見(jiàn)圖1（封四）。

2.2 不同試劑配伍染色結(jié)果

圖2可見(jiàn)，使用常規(guī)電鏡染色方法，鉛、鈾雙染法，在電鏡觀察不同倍數(shù)下（圖2A～C為傳統(tǒng)方法染色的心肌淀粉樣變整體圖，C圖設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照），可以清楚地將心肌組織中沉淀的淀粉樣物質(zhì)染色。而只進(jìn)行檸檬酸鉛單獨(dú)染色顯示結(jié)果呈陰性（圖2D）。醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛復(fù)染的心肌淀粉樣變圖，淀粉樣物質(zhì)染色結(jié)果清晰（圖2E）。并且無(wú)論是單獨(dú)鈾染色（圖2F），還是烏龍茶提取物代替醋酸鈾配伍鉛的染色方法和茶單獨(dú)染色（圖2G～H），均可以將心肌組織中沉淀的淀粉樣物質(zhì)染色。本實(shí)驗(yàn)中，茶鉛的配伍染色不僅可以將淀粉樣物質(zhì)染色，還可以將組織中的線粒體、肌絲、細(xì)胞間質(zhì)等基本結(jié)構(gòu)染色。加上鉛的復(fù)染，兩種染色結(jié)果（圖2E～I(xiàn)）均相同，淀粉樣物質(zhì)清晰可見(jiàn)。

2.3 不同染色方法染色結(jié)果

在嚴(yán)格控制污染的情況下，用滴染法獨(dú)立完成連續(xù)50張超薄切片的染色，需要耗時(shí)約4.5 h，每種染液約消耗1 mL;切片盒法耗時(shí)約1 h，每種染液約消耗約10 mL。在電鏡下觀察，兩種染色方法的染色結(jié)果均較理想，切片背景干凈、對(duì)比度高，所獲圖像清晰。

在研究中采用改進(jìn)后樣品制備方法比常規(guī)包埋方法縮短了2/3的時(shí)間（表1），制片后的染色結(jié)果相同。

3 討論

生物樣品的超薄切片染色在電鏡標(biāo)本制備過(guò)程中十分關(guān)鍵[13-15]，然而染色不慎造成的切片污染、染色不均時(shí)有發(fā)生。為了得到滿意的染色結(jié)果，電鏡工作者開(kāi)發(fā)了多種染色方法及裝置并不斷進(jìn)行改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)室采用的就是簡(jiǎn)易自制裝置——切片盒配伍石蠟?zāi)＞?，進(jìn)行封閉式浸染。切片盒染色法的優(yōu)點(diǎn)是銅網(wǎng)放置簡(jiǎn)單、順序清楚、數(shù)量多，且每張銅網(wǎng)空間相對(duì)獨(dú)立，有效防止了切片錯(cuò)亂及脫落，而且安全性及便利性較高。但沖洗需注意切片盒蓋與底板的小孔對(duì)齊，以保證清洗干凈，沖洗時(shí)間要較滴染法的時(shí)間稍延長(zhǎng)。除此之外超薄切片的染色效果還受多種因素影響，如染色液的濃度、溫度、pH值;一些技術(shù)因素，如固定劑和嵌入媒體[16]。因此本研究改進(jìn)樣品的制備方法，減少了步驟，節(jié)省了時(shí)間，用于茶代鈾的染色，更快速、安全地完成心肌活檢淀粉樣變的染色。既往的研究[17-19]表明OTE多酚不能進(jìn)入細(xì)胞并傷害細(xì)胞膜，但它們的肽鍵反應(yīng)和透射電子顯微鏡中的染色均增強(qiáng)。本研究結(jié)果提示，雖然采用OTE單染色和配伍鉛雙染色可以顯示大部分心肌組織結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)染色方法相比，一些結(jié)構(gòu)仍然可以觀察到細(xì)節(jié)上的差異，但淀粉樣物質(zhì)染色清晰，而且考慮到安全性因素，OTE是電子染色中醋酸鈾的非常有前景的替代品[20]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?孫洋，趙紅.電鏡在心臟疾病中的研究及診斷意義[J].臨床與病理雜志，2017，37（7）：1524-1528.

[2] ?李莉，段雪晶，孫洋，等.免疫組織化學(xué)指標(biāo)在心臟淀粉樣變性分型中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華病理學(xué)雜志，2018，47（2）：105-109.

[3] ?趙娟，張彥妹，鄭乃智.β-淀粉樣蛋白增加Wistar大鼠癲癇發(fā)作易感性的行為學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017， 14（27）：25-25，36.

[4] ?于洋，王鴻，田俊萍，等.心率變異性在冠心病中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（11）：56-59.

[5] ?HE Xiao-Hua，Bin L. LR-White resin and tea：a quick and safe bacterial cells preparation Method for transmission ?electron microscopy [J]. Microbiology China，2015，42（10）：2041-2047.

[6] ?Watson ML. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals [J]. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology，1958，4（6）：727-730.

[7] ?Kajikawa K，Yamaguchi T，Katsuda S，et al. An improved electron stain for elastic fibers using tannic acid [J]. J Electron Microsc（Tokyo），1975，24（4）：287-289.

[8] ?Tanaka K，Nakamura H. A comparison of four electron staining methods for elastic fibers [J]. Journal of Saitama Medical School，1986，13：219-226.

[9] ?Sato S，Sasaki Y，Adachi A，et al. Use of oolong tea extract（OTE）for elastin staining and enhancement in ultrathin sections [J]. Med Electron Microsc，2003，36（3）：179-182.

[10] ?Carpentier A，Abreu S，Trichet M，et al. Microwaves and tea：new tools to process plant tissue for transmission electron microscopy [J]. J Electron Microsc（Tokyo），2012， 247（1）：94-105.

[11] ?Nakakoshi M，Nishioka H，Katayama E. New versatile staining reagents for biological transmission electron microscopy that substitute for uranyl acetate [J]. J Electron Microsc（Tokyo），2011，60（6）：401-407.

[12] ?Miller AA，Simakova AV. Application of method of OTE staining of ultrathin sections based on example of microsporidia（Protozoa：Microsporidia）[J]. Cell and Tissue Biology，2010，4（1）：109-115.

[13] ?宋西嬌，陳浙，何步遠(yuǎn)，等.西瓜花葉病毒和小西葫蘆黃花葉病毒復(fù)合侵染南瓜的透射電鏡診斷[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2015，34（2）：126-131.

[14] ?張旭，程明，徐進(jìn)，等.透射電鏡在胸膜惡性腫瘤診斷中的作用[J].中國(guó)體視學(xué)與圖像分析，2015，20（1）：74-84.

[15] ?黃遠(yuǎn)潔，莫肖敏，孟春梅，等.3種常規(guī)透射電子顯微鏡超薄切片染色方法的對(duì)比分析[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，32（6）：912-913.

[16] ?Yamaguchi K，Suzuki K，Tanaka K. Examination of electron stains as a substitute for uranyl acetate for the ultrathin sections of bacterial cells [J]. J Electron Microsc（Tokyo），2010，59（2）：113-118.

[17] ?Sato S，Adachi A，Sasaki Y，et al. Oolong tea extract as a substitute for uranyl acetate in staining of ultrathin sections [J]. J Microsc，2008，229（1）：17-20.

[18] ?Miller AA，Simakova AV. Use of the OTE-staining method for ultrathin sections on the example of microsporidia（Protozoa：Microsporidia）[J]. Tsitologiia，2009，51（9）：741-747.

[19] ?Sato S，Kishikawa T. Ultrastructural study of the alveolar lining and the bronchial mucus layer by block staining with oolong tea extract：the role of various surfactant materials [J]. Med Electron Microsc，2001，34（2）：142-151.

[20] ?Stempak JG，Ward RT. An improved staining method for electron microscopy [J]. J Cell Biol，1964，22（3）：697-701.

（收稿日期：2019-05-05 ?本文編輯：劉永巧）