劉潔瓊 曹永清 李科 齊慧

[摘要] 目的 探討B(tài)CRF-1 mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)性及其對(duì)免疫功能的影響。 方法 選取2017年1月～2018年5月于長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）就診的54例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）作為研究對(duì)象，選取我院同期就診的50例非腫瘤性鼻咽患者作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BCRF-1 mRNA的表達(dá)水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高（P < 0.05）;TNM分期T3～T4期、N2～N3期鼻咽癌BCRF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于T1～T2期、N0～N1期（P < 0.05）;BCRF-1 mRNA高表達(dá)組CD4+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+明顯低于BCRF-1 mRNA低表達(dá)組，而CD8+T細(xì)胞比例明顯高于BCRF-1 mRNA低表達(dá)組（均P < 0.05）。 結(jié)論 BCRF-1 mRNA表達(dá)可能與鼻咽癌TNM分期T、N有關(guān)，同時(shí)其高表達(dá)對(duì)患者免疫功能有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] BCRF-1 mRNA;鼻咽癌;EB病毒;免疫功能;臨床病理特征

[中圖分類(lèi)號(hào)] R730.231? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（b）-0113-04

Relationship between the expression level of EB virus gene fragment and the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma

LIU Jieqiong? ?CAO Yongqing? ?LI Ke? ?QI Hui

Department of Hematology and Oncology， the First Hospital of Changsha， Hu'nan Province， Changsha? ?410005， China

[Abstract] Objective To explore the correlation of BCRF-1 mRNA expression with nasopharyngeal carcinoma and its influence on immune function. Methods A total of 54 patients with nasopharyngeal carcinoma （nasopharyngeal carcinoma group） who were admitted to the First Hospital of Changsha （“our hospital” for short） from January 2017 to May 2018 were enrolled in the study. At the same time， 50 cases of non-neoplastic nasopharyngeal patients treated at the same time in our hospital were selected as the control group. The expression of BCRF-1 mRNA was detected by real-time PCR， the T cell subsets were determined by flow cytometry. Results Compared with control group， the relative expression of BCRF-1 mRNA was significantly increased （P < 0.05）. And the relative expression of BCRF-1 mRNA in TNM stage T3-T4 and N2-N3 was significantly higher than that in TNM stage T1-T2 and N0-N1 stage （P < 0.05）. The percentage of CD4+ T cells and CD4+/CD8+ in the high expression of BCRF-1 mRNA group was significantly lower than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group， while the proportion of CD8+ T cells was significantly higher than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group （all P < 0.05）. Conclusion The expression of BCRF-1 mRNA are may be related to TNM stage T and N of nasopharyngeal carcinoma， and its high expression can inhibit the immune function of patients.

[Key words] BCRF-1 mRNA; Nasopharyngeal carcinoma; EB virus; Immune function; Clinicopathological features

流行病學(xué)研究證實(shí)，我國(guó)部分地區(qū)2010～2016年鼻咽癌的發(fā)病可達(dá)283/10萬(wàn)人～482/10萬(wàn)人[1]。臨床上鼻咽癌能夠?qū)е逻h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，增加腫瘤患者的病死率風(fēng)險(xiǎn)，縮短患者總體生存時(shí)間[2-3]。在探討鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同的基因或者腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠通過(guò)影響鼻黏膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征，干預(yù)自身免疫監(jiān)察作用，進(jìn)而影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。EB病毒基因片段（BCRF-1）是EB病毒的重要開(kāi)放編碼閱讀區(qū)，其能夠通過(guò)編碼VIL-10蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致鼻黏膜上皮細(xì)胞周期紊亂、加劇上皮細(xì)胞核DNA持續(xù)性異常擴(kuò)增[4-5]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA在鼻咽癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為BCRF-1 mRNA表達(dá)的增加與鼻咽癌的早期發(fā)生密切相關(guān)[6]，但缺乏對(duì)于BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者自身免疫功能關(guān)系的研究。為了揭示BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而為臨床上鼻咽癌的診療提供理論方面的參考，本研究探討了BCRF-1 mRNA的表達(dá)及其與鼻咽癌患者病情的關(guān)系，報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年5月長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的鼻咽癌患者54例（鼻咽癌組）作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理檢查確診;②患者及家屬知情同意;③鼻咽癌組患者病理診斷符合《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》[7]中關(guān)于鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤;②既往有免疫系統(tǒng)疾病或近期服用過(guò)影響免疫系統(tǒng)的藥物;③研究前有放化療等抗腫瘤治療。選取我院同期就診的非腫瘤性鼻咽患者50例作為對(duì)照組。兩組受試者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1? ?兩組一般資料比較

1.2 分期標(biāo)準(zhǔn)

鼻咽癌的TNM分期按照中國(guó)鼻咽癌分期2017版與UICC/AJCC分期第8版標(biāo)準(zhǔn)[8]。T分期：Tx：原發(fā)腫瘤無(wú)法評(píng)估;T0：未發(fā)現(xiàn)腫瘤，但有EB病毒陽(yáng)性且有頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié);T1：腫瘤局限于鼻咽，或侵犯口咽和/或鼻腔，無(wú)咽旁間隙受累;T2：腫瘤侵犯咽旁間隙和/或鄰近軟組織受累（翼內(nèi)肌、翼外肌、椎前?。?T3：腫瘤侵犯顱底骨質(zhì)結(jié)構(gòu)、頸椎、翼狀結(jié)構(gòu)和/或鼻旁竇;T4：腫瘤侵犯至顱內(nèi)，有顱神經(jīng)、下咽、眼眶、腮腺受累和/或有超過(guò)翼外肌的外側(cè)緣的廣泛軟組織侵犯。其中T1期7例、T2期10例、T3期24例、T4期13例。N分期：Nx：無(wú)法評(píng)估區(qū)域淋巴結(jié);N0：無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N1：?jiǎn)蝹?cè)頸部和/或咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（不論側(cè)數(shù)，最大徑≤6 cm，且位于環(huán)狀軟骨下緣以上區(qū)域）;N2：雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（最大徑≤6 cm，位于且環(huán)狀軟骨下緣以上區(qū)域）;N3：頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（不論側(cè)數(shù)，最大徑>6 cm和/或位于環(huán)狀軟骨下緣以下區(qū)域）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)BCRF-1 mRNA表達(dá)? 采集患者的外周靜脈血，加入0.2 mL的氯仿，2～8℃冰凍離心機(jī)中離心（12 000 r/min，離心15 min，半徑為10 cm），反復(fù)1次洗滌RNA，棄上清，在管底部可見(jiàn)乳白色沉淀物，加入1 mL 75%乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入BCRF-1 mRNA和GAPDH的上下游引物、0.1% DEPC，使其終濃度均為20 pmol/μL，制備反應(yīng)體系。RT-PCR擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48℃ 45 min，94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min 共40個(gè)循環(huán);循環(huán)完畢后68℃延伸7 min。RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物技術(shù)有限公司（日本Takara）（批號(hào)：20110357）。BCRF-1基因引物上游5′-CAAGGACCAACTACAACC-3′，下游5′-TGCCTCTTCTTTAATTG-3′;內(nèi)參GADPH引物上游5′-GGTGAAGCTCGGAGTCAACG -3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。結(jié)果按照2-ΔΔCt的方式進(jìn)行表達(dá)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群? 采集患者清晨空腹血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，采用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法進(jìn)行T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。相關(guān)標(biāo)記操作于5 mL抗凝管中進(jìn)行，100 μL全血與CD4-FITC/CD8-PE抗體室溫反應(yīng)25 min，采用紅細(xì)胞裂解液Optilyse C溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS液體洗滌3遍，每次5 min，生理鹽水重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。（FACS calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，threg檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司，貨號(hào)：20120387，稀釋度：1∶500）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組和對(duì)照組BCRF-1 mRNA表達(dá)水平比較

鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.895±0.103），明顯高于對(duì)照組（0.355±0.097），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 24.470，P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

M：Marker;1：對(duì)照組;2：鼻咽癌組

圖1? ?鼻咽癌組與對(duì)照組BCRF-1 mRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析

TNM分期T3～T4期、N2～N3期的鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達(dá)量明顯高于TNM分期T1～T2期、N0～N1期（均P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 鼻咽癌患者中BCRF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系分析

依據(jù)本研究中患者BCRF-1 mRNA平均相對(duì)表達(dá)量，將鼻咽癌患者分為BCRF-1 mRNA高表達(dá)組（表達(dá)量>0.895）和BCRF-1 mRNA低表達(dá)組（表達(dá)量 ≤0.895）。與BCRF-1 mRNA低表達(dá)組比較，BCRF-1 mRNA高表達(dá)組CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比例較低，而CD8+T細(xì)胞比例較高（均P < 0.05）。見(jiàn)表3。

表3? ?不同BCRF-1基因表達(dá)鼻咽癌患者T細(xì)胞亞群比較（x±s）

3 討論

在長(zhǎng)期吸煙或者合并有相關(guān)家族史的患者中，鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高，特別是在合并有EB病毒感染的人群中，鼻咽癌的發(fā)生率可進(jìn)一步上升[9]?，F(xiàn)階段臨床上通過(guò)手術(shù)或者放療措施治療鼻咽癌，其能夠提高鼻咽癌的治療水平，延長(zhǎng)鼻咽癌患者的總體生存時(shí)間[10-12]。但長(zhǎng)期的隨訪研究證實(shí)，鼻咽癌治療后生存轉(zhuǎn)歸的改善仍然不明顯，治療后鼻咽癌患者的病情惡化速度仍然較快。而本研究對(duì)鼻咽癌發(fā)展過(guò)程中基因因素的探討，有助于揭示鼻咽癌的發(fā)生機(jī)制，并為鼻咽癌患者的臨床診療提供理論前提。

臨床上鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，不同病理性因素的改變，均有提高鼻黏膜上皮細(xì)胞異常增殖的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的改變。EB病毒感染在促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，其能夠通過(guò)整合宿主細(xì)胞，增加鼻黏膜上皮細(xì)胞G1/S期的細(xì)胞比例，提高癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和黏附能力。而B(niǎo)CRF-1 mRNA作為EB病毒的非編碼開(kāi)放閱讀區(qū)，其能夠通過(guò)分泌VIL-11蛋白，進(jìn)而調(diào)控上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及分化過(guò)程。相關(guān)的基礎(chǔ)研究也證實(shí)，BCRF-1 mRNA的表達(dá)能夠提高染色體DNA的擴(kuò)增速度，并能夠通過(guò)甲基化或者磷酸化的修飾，降低癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的基因錯(cuò)配修復(fù)能力，促進(jìn)癌基因的突變和癌細(xì)胞的擴(kuò)增[13]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BCRF-1 mRNA表達(dá)濃度的上升與鼻咽癌患者病死率或者總體生存時(shí)間密切相關(guān)[14]，但缺乏對(duì)于BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系研究。

本研究顯示，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較，濃度明顯上升，提示了BCRF-1 mRNA的高表達(dá)能夠參與鼻咽癌的病情過(guò)程。通過(guò)匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為這主要與BCRF-1 mRNA以下幾個(gè)方面的病理性作用有關(guān)[15-16]：①BCRF-1 mRNA的上升能夠通過(guò)提高鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)腫瘤信號(hào)通路的激活程度，激活A(yù)KT或者NF-κB，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖;②BCRF-1 mRNA的上升能夠影響到鼻黏膜上皮細(xì)胞周期，導(dǎo)致癌細(xì)胞快速跨越G0期的能力明顯增加。楊璐等[17]研究者也認(rèn)為，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達(dá)濃度可平均上升35%以上，特別是在中晚期鼻咽癌患者或者遠(yuǎn)期生存時(shí)間較短的患者中，BCRF-1 mRNA的表達(dá)可進(jìn)一步上升。本研究在探討相關(guān)因子與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNM分期晚或者已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其BCRF-1 mRNA表達(dá)水平可明顯上升，這主要是由于BCRF-1 mRNA的表達(dá)能夠增加癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力，提高鼻黏膜上皮細(xì)胞浸潤(rùn)深度，延長(zhǎng)TNM分期;而B(niǎo)CRF-1 mRNA可以同時(shí)提高癌細(xì)胞對(duì)于鎖骨下或者頸部淋巴結(jié)的黏附能力，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。但部分研究者并不認(rèn)為BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18-20]，這與本研究存在一定的差別，主要考慮與BCRF-1 mRNA的檢測(cè)靈敏度差別有關(guān)。最后本研究發(fā)現(xiàn)，BCRF-1 mRNA高表達(dá)組CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯下降，而CD8+T淋巴細(xì)胞明顯上升，提示BCRF-1 mRNA的表達(dá)與鼻咽癌患者的T淋巴細(xì)胞功能密切相關(guān)，這主要由于BCRF-1 mRNA能夠?qū)е伦陨砻庖咛右莸陌l(fā)生，并影響到樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈功能，進(jìn)而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群的改變[21-22]。

本研究的創(chuàng)新性在于探討了BCRF-1 mRNA的表達(dá)與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系。綜上所述，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達(dá)明顯上升，BCRF-1 mRNA的表達(dá)與患者TNM分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)BCRF-1 mRNA的表達(dá)還能夠影響到患者的T淋巴細(xì)胞功能。

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（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：張瑜杰）