謝 晶，曹 冶，李 琰，殷明郁，于吉峰，李興玉，康潤(rùn)敏，張金靈

（四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

仔豬腹瀉是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下的一種典型的多因素性疾病，對(duì)仔豬成活率和后期增重都具有嚴(yán)重影響，是目前最為嚴(yán)重的仔豬疾病之一[1-2]。仔豬腹瀉發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，常表現(xiàn)為交叉混合感染，導(dǎo)致臨床診斷與防治困難，為養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC）是導(dǎo)致仔豬腹瀉發(fā)生的主要病原菌，在我國(guó)大約有35%的病例由ETEC引起，部分仔豬會(huì)繼發(fā)感染沙門(mén)氏菌[3-8]。目前在生產(chǎn)中主要使用抗生素對(duì)仔豬腹瀉進(jìn)行預(yù)防和治療，但由于抗生素的濫用，不僅使得病原微生物產(chǎn)生耐藥性，降低藥物療效，而且，這些藥物大量使用會(huì)造成畜產(chǎn)品中藥物殘留，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，以天然中草藥為原材料或以中草藥與西藥相結(jié)合來(lái)防治仔豬腹瀉日益受到重視[9-11]，藏藥作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥的一個(gè)重要組成部分，具有很好的研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。本研究選擇17味藏藥對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉主要病原菌產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，利用瓊脂擴(kuò)散法和試管二倍稀釋法篩選出對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉敏感的藏藥，為仔豬細(xì)菌性腹瀉藏藥防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年8月至2018年8月在四川省畜牧科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 菌株

產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌BNCC186736和豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC3383為標(biāo)準(zhǔn)株，分別購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司和中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 藏藥

選擇矮紫堇、波棱瓜子、烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤、茜草、翼首草、狼毒、千里光、甘松、虎耳草、訶子、刺柏、藏木香、無(wú)患子共17味藏藥，作為本次研究所用藥物，全部藥物購(gòu)自成都市荷花池中藥材專業(yè)批發(fā)市場(chǎng)。

1.4 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自四川達(dá)文西科技有限公司，Mueller-Hinton瓊脂購(gòu)自O(shè)IOID LTD。

1.5 菌液的制備及計(jì)數(shù)

菌種復(fù)蘇，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12 h。

1.6 藏藥提取的制備

將已篩選17味藏藥經(jīng)粉碎至粗粉，分別制備水提取物和乙醇提取物，用于體外抑菌作用研究。1.6.1水粗提取物的制備 稱取各藏藥生藥粉末100 g，用濾紙包好后放入索氏抽提器中，加入中性去離子水索氏提取5 h，回收水提取物，在水浴鍋上濃縮并定容，即得水粗提取物，最終濃縮液的藥物濃度見(jiàn)表1，無(wú)菌分裝后放入-20℃冰箱備用。藥物編號(hào)X-1。

1.6.2 乙醇粗提取物的制備 稱取各藏藥粗粉100 g，用濾紙包好后，放入索氏抽提器中，加入無(wú)水乙醇索氏提取6 h，回收乙醇提取物，在水浴鍋上濃縮并定容，最終濃縮液的藥物濃度見(jiàn)表1，紫外線照射滅菌獲得乙醇粗提取物，無(wú)菌分裝后放入-20℃冰箱備用。藥物編號(hào)X-2。

1.7 單味藏藥粗提取物藥物敏感性試驗(yàn)

參照YY-T 1191-2011抗菌劑藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將紙片滴加20 μL提取液，無(wú)菌烘干備用。培養(yǎng)基采用Mueller-Hinton瓊脂。將培養(yǎng)菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?。用無(wú)菌棉拭蘸取稀釋過(guò)的菌液，均勻涂布整塊瓊脂培養(yǎng)基表面，室溫3～5 min后，貼加含藥紙片，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，測(cè)定其紙片周圍抑菌環(huán)直徑的大小3次，計(jì)算其平均值即為試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 單味藏藥粗提取物藥物最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

粗提取物蒸干稱重后定容，計(jì)算粗提取物濃度，采用試管二倍稀釋法進(jìn)行，確定中藥最小抑菌濃度（MIC）。取無(wú)菌的試管9支進(jìn)行編號(hào)，除第1管加入1～1.5 mL MH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1 mL，在第1管加入提取物原液0.5～1 mL，終體積為2 mL，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第8管，并從第8管中吸取1 mL棄去，第9管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。之后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 mL，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/mL。置35℃普通空氣孵箱中孵育24 h。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC。

2 結(jié)果

2.1 藏藥粗提取物生藥濃度

將17味藏藥粉碎，進(jìn)行水提取、乙醇提取，濃縮獲得粗提取物，并計(jì)算生藥濃度，各藏藥粗提取物生藥濃度見(jiàn)表1。

表1 藏藥粗提取物生藥濃度 g/mL

2.2 單味藏藥粗提取物藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示，產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株BNCC186736對(duì)烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤、狼毒、甘松、訶子8味藥物敏感。其中，余甘子的水粗提取物和乙醇粗提取物都有顯著的抑菌效果；訶子的水粗提取物有顯著的抑菌效果，而醇粗提取物沒(méi)有抑菌效果；烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、螃蟹甲、寬解藤、狼毒、甘松的乙醇粗提取物有顯著的抑菌效果，而水粗提取物沒(méi)有抑菌效果。豬霍亂沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3383對(duì)多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、訶子4味藥物敏感。其中，多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物有顯著的抑菌效果，而水粗提取物沒(méi)有抑菌效果；余甘子、訶子的水粗提取物有顯著的抑菌效果，而乙醇粗提取物沒(méi)有抑菌效果。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 單味藏藥藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.3 單味中藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果

選取對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株BNCC 186736和豬霍亂沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3383均有抑菌效果的藏藥余甘子、訶子水粗提取物和多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物，測(cè)定最小抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果顯示，余甘子、訶子的水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌的抑菌效果最好，兩味藏藥的最小抑菌濃度分別為1.516 mg/mL和6.065 mg/mL；多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌也具有較好的抑菌效果，兩味藏藥的最小抑菌濃度分別為41.333 mg/mL和94.302 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 單味藏藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3 討論

藏藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)的一個(gè)重要組成部分，傳統(tǒng)藏藥中有許多具有治療細(xì)菌性感染性疾病的功效[13]。目前臨床治療中抗生素耐藥性菌株的增多以及化學(xué)藥物的副作用，使得從天然藥物中分離篩選新的抗菌藥物成為趨勢(shì)和熱點(diǎn)。

本研究選取矮紫堇、波棱瓜子、烏奴龍膽、多刺綠絨蒿等17味藏藥均具有清熱解毒抗感染的作用，體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤等8味藏藥具有較好的抑菌效果，矮紫堇、波棱瓜子、虎耳草等9味藏藥未表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。在具有抑菌效果的8味藏藥中，除訶子外的7味藏藥的乙醇粗提取物均具有抑菌活性；而僅有余甘子、訶子2味藏藥的水粗提取物具有抑菌活性。從中篩選出對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉主要病原菌產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌均有抑菌作用的藏藥4味，分別為余甘子、訶子、多刺綠絨蒿和螃蟹甲，其中又以余甘子、訶子的水粗提取物的抑菌效果最好，為仔豬細(xì)菌性腹瀉藏藥防治提供理論基礎(chǔ)。

余甘子是大戟科葉下珠屬植物余甘子的果實(shí)，在藏藥、蒙藥、維藥、彝藥等中都有廣泛應(yīng)用。余甘子含有多種維生素、微量元素、氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、糖類等[14]，研究表明余甘子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、大腸埃希氏菌等均有抑菌活性，抗菌譜較廣[15-17]。本試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，余甘子的乙醇粗提取物和水粗提取物都有顯著的抑菌效果。其乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌具有抑菌作用，水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌均有抑菌作用，且抑菌效果最好，最小抑菌濃度為1.516 mg/mL。

訶子是使君子科欖仁樹(shù)屬植物訶子及其變種絨毛訶子的干燥成熟果實(shí)，在我國(guó)民間用藥較廣泛，在藏藥中有“藥中之王”之稱[18]。訶子化學(xué)成分豐富，含鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油等，研究表明訶子提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌效果[18-20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，訶子的水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，最小抑菌濃度為6.065 mg/mL。

多刺綠絨蒿是罌粟科綠絨蒿屬多刺綠絨蒿的全草，為藏醫(yī)習(xí)用藥，具有清熱止痛、活血化瘀等功效[21-22]?，F(xiàn)代研究表明多刺綠絨蒿含有生物堿、黃酮、萜類等成分，其中的血根堿的酸性硫酸鹽、桂皮酸、白屈菜紅堿等成分對(duì)某些細(xì)菌具有顯著的抑制作用[23]，但少見(jiàn)多刺綠絨蒿提取物抑菌效果的研究報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌均有抑菌作用，最小抑菌濃度為41.333 mg/mL。

螃蟹甲是唇形科糙蘇屬多年生草本植物螃蟹甲的干燥塊根，是藏醫(yī)常用傳統(tǒng)藏藥。螃蟹甲主要含有環(huán)烯醚萜苷類、呋喃拉布素型二萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油類等化合物，具有祛風(fēng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、清熱消腫、止咳祛痰、抗感染等作用[24-25]。研究表明，螃蟹甲提取物對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌作用[13，26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，螃蟹甲的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌均有抑菌作用，最小抑菌濃度為94.302 mg/mL。