李 凡，趙坤坤，劉守川

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000）

腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的疾病之一，各日齡豬均可發(fā)病，可造成哺乳仔豬大量死亡，使世界養(yǎng)豬業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟損失。臨床上有多種原因可引起豬腹瀉，如病毒病、細菌病、寄生蟲病、營養(yǎng)性以及中毒等因素均可導(dǎo)致豬腹瀉的發(fā)生，而豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是臨床上引起腹瀉的重要病原之一[1]。豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由PEDV引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[2]，以腹瀉、嘔吐和脫水為典型癥狀。一年四季均可發(fā)病，冬、春季節(jié)多發(fā)。不同年齡、性別和品種的豬均可感染，其中哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率最高，成年豬癥狀較輕，但可長期隱性帶毒[3]。

PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、α冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）成員，PEDV為有囊膜的、不分節(jié)段的、單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb[4]，主要包含編碼結(jié)構(gòu)蛋白的S、E、M和N基因，以及編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的ORF3基因[5]。S基因編碼的纖突糖蛋白（S蛋白），在病毒粒子與細胞表面受體結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細胞和在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[6]。PEDV的ORF3基因位于S基因下游的第116～784個核苷酸處，編碼224個氨基酸，ORF3編碼的蛋白是唯一的輔助蛋白[7]。

豬流行性腹瀉是影響當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一，自2010年底，PED在我國大規(guī)模暴發(fā)[8-9]，一直未能得到有效控制，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失[10]。而河南地區(qū)的PEDV流行情況還有待于進一步的研究。對當(dāng)前養(yǎng)殖場中PEDV流行毒株的S基因進行測序，采用生物信息學(xué)軟件將S基因序列與GenBank收錄的PEDV參考毒株進行同源性比較、遺傳進化分析，有助于闡明PEDV流行毒株致病機制、摸清PEDV的流行特點和變異情況，為該病的免疫防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2018年河南部分地區(qū)腹瀉發(fā)病豬場采集、剖檢并取典型病變部位組織，送至實驗室，-20℃保存、待檢。

1.2 主要試劑

36T核酸提取試劑盒和64T核酸提取試劑盒均為洛陽愛森生物科技有限公司產(chǎn)品；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP Mix、5 U/μL rTaq DNA 聚 合 酶 、6 ×Loading Buffer和瓊脂糖均為TaRaKa公司產(chǎn)品；溴化乙錠為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；1×TAE電泳緩沖液、滅菌雙蒸水、青霉素、鏈霉素和1×PBS為實驗室自配。

1.3 引物的設(shè)計和合成

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)中的引物和GenBank中發(fā)表的基因組序列設(shè)計擴增的引物，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，具體的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 總RNA的提取、cDNA的反轉(zhuǎn)錄和各基因片段的擴增

按照洛陽愛森生物科技有限公司核酸提取試劑盒的說明書操作，提取總RNA；參考EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系并進行反轉(zhuǎn)錄。按照TaRaKa公司rTaq DNA聚合酶說明書配制PCR體系，PCR反應(yīng)程序為 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51～56 ℃ 40 s，72 ℃40～50 s，共 35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 結(jié)束后，取6 μL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并用紫外凝膠成像儀拍照。

1.5 PCR產(chǎn)物測序

將PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的引物送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序。

1.6 測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果用DNA Star軟件中的Seqmen進行序列分析，并用Megalign進行同源性分析，同時用MEGA 6.0進行分析并繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹瀉相關(guān)病原的檢測

對河南省內(nèi)4個地區(qū)的10份病料按照采樣時間進行命名（表2），并進行腹瀉相關(guān)病毒的RTPCR檢測（圖1，A），結(jié)果表明，大部分豬場的腹瀉多為混合感染，有的甚至多達3種病毒混合感染，其中PEDV的檢出率最高，為80.0%，其次為PoRV，為30.8%，TGEV的檢出率為7.7%。

2.2 PEDV S基因的擴增

對PEDV檢測為陽性的8份病料進行S基因部分序列的擴增。電泳結(jié)果顯示（圖1，B），8份樣品分別在532 bp處有特異性擴增條帶，與預(yù)期相符。

表2 PEDV河南分離株信息及編號

圖1 腹瀉相關(guān)病毒和PEDV S基因PCR結(jié)果

2.3 基因序列核苷酸同源性分析

8株P(guān)EDV的S基因部分序列相互之間的核苷酸同源性為82.8%～100%（圖2），它們與參考毒株序列（表3）的同源性為82.2%～100%。其中180276-3和180276-6與DR-13的同源性最高，分別為94.9%、94.7%，180278-1與AJ1102的同源性最高，為97.8%，180435-1與DR-13的同源性最高，為95.2%，181212-1與CV777和SD-M的同源性最高，均為99.2%，181737-1和181737-2與HEN-ZMD-2012和K14JB01等的同源性最高，均為100%，181753-1與DR-13的同源性最高，為94.9%。

表3 PEDV參考毒株信息

2.4 遺傳進化分析

根據(jù)S基因構(gòu)建的進化樹分為2個基因群，第1個和第2個基因群均又分為3個基因亞群（圖3）。本實驗室擴增的基因序列分別屬于4個基因亞群，181737-1和181737-2屬于第1個基因群的第1亞群，為流行株，與HEN-ZMD-2012最相似；180278-1屬于第1個基因群的第2亞群，為流行株，與HeN-2018 最 相 似 ；180276-3、180276-6、180435-1 和181753-1屬于第2個基因群的第1亞群，更接近于經(jīng)典株，與LZC最相似；181212-1屬于第2個基因群的第3亞群，更接近于疫苗株，與CV777最相似。

圖2 PEDV S基因與參考毒株的同源性分析結(jié)果

圖3 PEDV S基因進化樹結(jié)果

2.5 PEDV S基因突變位點分析

臨床的PEDV疫苗多為CV777，將河南地區(qū)的PEDV毒株與CV777比較，發(fā)現(xiàn)其S基因存在不同位點的氨基酸位點的突變、插入和缺失，具體見表4。

3 討論

PEDV是當(dāng)前引起仔豬腹瀉的重要病原之一，仔豬感染后主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉、脫水并死亡。本試驗對5個豬場的10份臨床樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV檢出率為80.0%，PoRV為30.8%，TGEV僅為7.7%，由此可知，PEDV和PoRV在腹瀉病例中發(fā)揮重要的作用，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果類似[11]。多種腹瀉病原的檢出也表明了臨床養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬群腹瀉病原的多樣化和復(fù)雜化，臨床上的豬腹瀉疫情防控將變得更加嚴(yán)峻。臨床檢測腹瀉的豬場大多已經(jīng)免疫了TGEV-PEDV二聯(lián)疫苗，但這些豬場均檢出了PEDV，說明二聯(lián)疫苗不能為現(xiàn)有的流行毒株提供有效的保護，所以對于PEDV流行毒株的S基因的分子流行病學(xué)監(jiān)測，對預(yù)防和控制PED具有重要意義。

本試驗擴增的S基因部分片段位于S1區(qū)，含有PEDV的中和抗原表位[12-13]，S基因核苷酸同源性比對發(fā)現(xiàn)，不同病料樣品的S基因與不同的參考株的同源性有差別。對S基因進行遺傳進化分析可知，S基因在地域上有差異，不同地域的樣品屬于不同的基因群和基因亞群，并與不同的代表毒株在一個分支。本試驗將河南地區(qū)的8株P(guān)EDV的S基因和疫苗毒株CV777的S基因的氨基酸位點進行比對發(fā)現(xiàn)：所有毒株均有不同程度的氨基酸位點的突變，從表4中可知，181212-1有5個突變，與CV777最相似，181753-1有 9個突變，180276-3、180276-6和180435-1均有10個突變，181737-1和181737-2均有32個突變，均有2個缺失和3個插入，180278-1有34個突變，有2個缺失和3個插入。這些氨基酸位點的突變可能會影響S抗原位點產(chǎn)生中和抗體的能力，從而改變流行毒株的抗原性。這對做好PEDV的防控、選擇合適的PEDV疫苗株提供了理論參考。

表4 S基因推導(dǎo)氨基酸突變與CV777比對分析結(jié)果