龍得雨，王艷珍，王永福，陳春環(huán)，吉萬全，王亞娟

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學觀測實驗站，陜西楊凌 712100)

小麥是世界上廣泛種植的糧食作物，全世界約有40%的人口以小麥為主要食糧[1]。由于小麥在基因組多倍化、馴化和育種過程中僅保留了其遺傳多樣性的一部分，遺傳基礎的逐步縮小使現(xiàn)代小麥品種極易受到病害侵襲[2]。小麥近緣種(包括野生和栽培)是小麥抗性基因的重要來源[3]，因此，開發(fā)和利用小麥的近緣種可有效地拓寬其遺傳基礎，增加其遺傳多樣性。卵穗山羊草(AegilopsgeniculateRoth)是一年生自花授粉異源四倍體植物，染色體構(gòu)型為UgUgMgMg，其中染色體Ug組來源于小傘山羊草(Ae.umbellulataZhuk.)，Mg染色體組來源于丁芒山羊草(Ae.comosaSibth.et Sm.)，具有抗病、抗蟲、耐鹽、耐寒、耐熱、早熟等特性，是小麥改良中重要的種質(zhì)資源[4-5]。

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的威脅全球小麥生產(chǎn)的一種毀滅性的真菌病害[6]，在中國曾多次大流行，特別是在中國西部麥區(qū)尤為嚴重[7]。目前，防治小麥條銹病的途徑主要有種植抗病品種和化學防治兩種，種植抗病品種是防治條銹病最經(jīng)濟有效的措施[8]。白粉病(致病菌Blumeriagraminisf.sp.tritici)是中國小麥生產(chǎn)上的重要病害之一，該病頻繁發(fā)生，危害嚴重，嚴重威脅著小麥生產(chǎn)安全[9]。由于小麥條銹病和白粉病分布廣泛、生理小種復雜多變，常常導致品種抗性頻繁喪失，引起病害流行[10]。因此，亟需開發(fā)新的抗病基因。利用小麥近緣種創(chuàng)制、篩選和鑒定出新的帶有抗性基因的材料，可為進一步將抗性基因轉(zhuǎn)移到小麥中奠定基礎。

本課題組前期以中國春(CS)為母本、卵穗山羊草SY159為父本進行雜交，F(xiàn)1代與CS回交，再經(jīng)過連續(xù)自交，得到BC1F8群體，并且篩選得到7M附加系和7M(7A)代換系。1003是從BC1F8群體中篩選出的、體細胞染色體數(shù)目為44條的衍生后代。本研究擬通過細胞學、原位雜交(GISH和FISH)和分子標記等技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學以及白粉病和條銹病抗性調(diào)查，對小麥-卵穗山羊草衍生后代1003進行鑒定，以期明確該種質(zhì)的染色體構(gòu)型以及外源染色體的同源群關(guān)系，為其在小麥品種改良和抗病育種中的有效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料包括普通小麥品種中國春(CS)、輝縣紅、陜優(yōu)225、銘賢169，以及卵穗山羊草SY159、中國春-卵穗山羊草衍生后代1003、小麥-卵穗山羊草7M附加系[5]和小麥-卵穗山羊草7M(7A)代換系，均由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院染色體工程實驗室提供，并在西北農(nóng)林科技大學北校區(qū)試驗田嚴格套袋自交，收獲種子。

白粉菌生理小種為E09，來源于西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院；條銹菌生理小種為條中29(CYR29)、條中23(CYR23)、條中31(CYR31)和條中32(CYR32)等，均由西北農(nóng)林科技大學植保學院提供。

1.2 細胞學鑒定

參照朱 晨等[11]的方法對田間所取的根尖和幼穗分別進行不同的處理，并鏡檢。采用的熒光顯微鏡為Olympus BX-53(日本)，CCD 成像系統(tǒng)。采用Photoshop CS5軟件處理圖像。

1.3 原位雜交

在23 ℃黑暗培養(yǎng)箱中將種子置于培養(yǎng)皿中濕潤的濾紙上培養(yǎng)2～3 d，待根長至2 cm左右時，取下根尖置于濕潤的打孔離心管中，笑氣(N2O)處理2～3 h，用90%的醋酸固定根尖5～10 min，ddH2O洗滌2～3遍后，加入70%的酒精，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。參照Han等[12]的方法制備根尖染色體中期的片子，利用相差顯微鏡鏡檢篩選出好的片子，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。參照十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取卵穗山羊草SY159的基因組DNA[13]，通過切口移位(nick translation)法用熒光素Texas Red-dCTP標記探針，以CS的DNA為封阻，對1003進行基因組原位雜交(GISH)分析。參照Tang等[14]的方法，利用Tamra(6-carboxytetramethylrhodamine)修飾的寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和6-FAM(6-carboxyfluorescein)修飾的寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠色)進行熒光原位雜交(FISH)分析。參照Tang等[15]的方法，利用Tamra修飾的寡核苷酸探針Oligo-44(紅色)對特定染色體進行非變性熒光原位雜交(Non-denaturing fluorescenceinsituhybridization,ND-FISH)分析。寡核苷酸探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鏡檢采用Olympus BX-53熒光顯微鏡，使用CCD成像系統(tǒng)進行圖像采集，并用Photoshop CS5軟件處理。

1.4 分子標記

參照CTAB法提取供試材料的基因組DNA[13]，利用表達序列標簽(expressed sequence tag,EST)和PLUG(PCR based landmark unique gene)引物分別進行擴增，比較卵穗山羊草SY159和1003是否存在與CS特異的擴增條帶，進一步確定1003中外源染色體的同源群歸屬。PLUG引物來源于已公開發(fā)表的文章[16]，EST引物從網(wǎng)站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)中選取，由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增體系和反應程序均參照朱 晨等[11]的方法，擴增產(chǎn)物均采用8%非變性的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，用1%的硝酸銀溶液染色后顯影并拍照。

1.5 白粉病和條銹病抗性鑒定

苗期白粉病抗性鑒定在室內(nèi)培養(yǎng)箱中進行，種植于穴盤中，每穴為邊長4 cm的小室，每穴10粒，重復3次，感病對照陜優(yōu)225在穴盤中隨機種植。當材料長至兩葉一心期時，通過自然傳播和人工抖落的方式接種白粉菌生理小種E09。接種15 d后，待感病對照充分發(fā)病后，參照盛寶欽[17]劃分的6級標準記載苗期白粉病的反應型，0、0；、1、2、3、4型分別表示免疫、近免疫、高抗、中抗、中感和高感。

苗期條銹病抗性鑒定在西北農(nóng)林科技大學植物病理研究所溫室中進行，鑒定方法參照相關(guān)文獻[18-19]，將參鑒材料種植于8 cm×8 cm的花盤中，每份材料種10粒，待材料長至2葉期，將條銹菌與滑石粉按照1∶50的比例混合，抖粉法接菌，分別接種條銹菌生理小種CYR29、CYR23、CYR31和CYR32，以輝縣紅和銘賢169為感病對照。接種后15 d左右，待感病對照充分發(fā)病時按照0～4級標準[20]記載反應型，此后每3 d重復鑒定一次，連續(xù)鑒定3次。

1.6 農(nóng)藝性狀調(diào)查

試驗材料于2017年10月上旬種植在西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院試驗田，行長1.0 m，行間距 0.25 m，材料種植間距為5～10 cm；2018年成熟期每份材料隨機選取10株調(diào)查株高、穗形、穗長、小穗數(shù)性狀，收獲后，對其千粒重、粒長和粒寬等性狀進行調(diào)查，參考李立會等[21]的標準進行數(shù)據(jù)記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞學分析結(jié)果

對1003的根尖和穗子進行鏡檢，結(jié)果表明，根尖體細胞有絲分裂中期含有44條染色體(圖1A)；花粉母細胞減數(shù)第一次分裂中期含有22對二價體(圖1B)且配對良好；花粉母細胞減數(shù)第一次分裂后期含有44條染色體且均等分離(圖1C)。這些結(jié)果表明1003在細胞學上已經(jīng)高度穩(wěn)定。

圖1 1003在有絲分裂中期(A,2n=44)、減數(shù)分裂中期I(B,2n=22 II)和后期I(C,2n=44)的染色體特征Fig.1 Mitotic(A,2n=44),meiotic metaphase I(B,2n=22 II),and meiotic anaphase I (C,2n=44) chromosome characteristics of 1003

2.2 基因組原位雜交結(jié)果

以卵穗山羊草SY159的基因組DNA來標記探針，以CS的基因組DNA作為封阻，DAPI(藍色)復染，進行GISH分析。結(jié)果(圖2)表明，1003是攜帶42條小麥染色體和2條卵穗山羊草SY159染色體的二體附加系。

2.3 分子標記分析結(jié)果

為了確定外源染色體的同源群歸屬，利用本實驗室現(xiàn)有的72對EST引物和135對PLUG引物進行分子標記分析，這些引物在7個同源群中均有分布。經(jīng)過篩選，共得到1對EST引物和6對PLUG引物能在1003中擴增出與卵穗山羊草SY159相同的特異性條帶，這些引物均屬于第7同源群(表1)，表明1003中的外源染色體來源于第7同源群，為7M或7U。利用篩選出的這7個特異性分子標記比較CS、卵穗山羊草SY159、1003、7M附加系和7M(7A)代換系的差異，結(jié)果(圖3)表明，1003與7M附加系和7M(7A)代換系中均存在與卵穗山羊草SY159相同的特異性條帶，且?guī)鸵恢?，表?003所攜帶的外源染色體為7M。

紅色為卵穗山羊草基因組DNA探針。

The red is the genomic DNA probe ofAe.geniculataRoth.

圖2 1003的根尖細胞基因組原位雜交(GISH)結(jié)果

Fig.2Genomicinsituhybridization(GISH)results in root tip cell of 1003

M：DL2000；1：中國春；2：卵穗山羊草SY159；3：1003；4：7M(7A)代換系；5：7M附加系；6：1003；A～F依次為PLUG引物TNAC1941、TNAC1888、TNAC1929、TNAC1868、TNAC1845、TNAC1782的擴增結(jié)果；G為EST引物BE637663擴增結(jié)果；F為HAEIII酶切;A～E為TaqI酶切；箭頭所指為卵穗山羊草特異條帶。

M:DL2000;1:Chinese Spring(CS);2:Ae.geniculataRoth SY159;3:1003;4: 7M(7A) substitution line;5:7M additional line;6:1003;A-F is the PLUG markers amplification results with TNAC1941, TNAC1888, TNAC1929,TNAC1868, TNAC1845, TNAC1782;G is the EST marker amplification results with BE637663;F is theHAEIII digestion;A-E is theTaqI digestion; The arrow refers to theAe.geniculataRoth SY159 specific band.

圖3 EST和PLUG引物在1003、中國春、卵穗山羊草SY159、7M附加系和7M(7A)代換系中的擴增結(jié)果

Fig.3Amplification results with EST and PLUG markers in 1003,CS,Ae.geniculataRothSY159,7M addition line and 7M(7A) substitution line

2.4 熒光原位雜交分析結(jié)果

以寡核苷酸探針Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2對1003進行多次FISH分析(圖4B)，與CS的標準核型[14]進行比較，可區(qū)分出38條與CS信號完全一致的染色體，2對FISH信號發(fā)生變異的小麥染色體，其中4A染色體頂端的綠色信號均丟失，另一對FISH信號變異的染色體推測為5A；一對兩端具有Oligo-pTa535信號的外源染色體，且與7M附加系(圖4C)和7M(7A)代換系(圖4 D)中的7M染色體的FISH核型主體信號一致，但略有差異。結(jié)合分子標記的結(jié)果，可以確認1003中的外源染色體為7M。為了進一步確認FISH信號變異染色體是否為5A，利用寡核苷酸探針Oligo-44對1003進行多次ND-FISH分析(圖5A)，與Tang等[15]的特定染色體的標準核型相比較，并在同一個根尖細胞中利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2對Oligo-44的結(jié)果進一步驗證(圖5B)，結(jié)果表明，這對FISH信號變異的染色體為5A。

表1 1003與卵穗山羊草SY159中具有特異條帶的EST和PLUG標記Table 1 EST and PLUG markers with specific bands in 1003 and Ae.geniculate Roth SY159

2.5 白粉病和條銹病抗病性鑒定結(jié)果

室內(nèi)苗期接種白粉菌生理小種E09進行白粉病抗性鑒定，結(jié)果(圖6)表明，CS和感病對照陜優(yōu)225的反應型為4級，表現(xiàn)為高感；卵穗山羊草SY159的反應型為0級，表現(xiàn)為免疫；1003、7M附加系和7M(7A)代換系的反應型均為0級，表現(xiàn)為免疫。結(jié)果表明1003攜帶有抗白粉病生理小種E09的基因，且來源于卵穗山羊草的7M染色體。

溫室內(nèi)分別接種條銹菌生理小種CYR29、CYR23、CYR31和CYR32，對7M附加系、7M代換系和1003及其親本CS、卵穗山羊草SY159進行鑒定，以輝縣紅和銘賢169為感病對照。結(jié)果(表2，圖7)表明，卵穗山羊草對這4個條銹生理小種的反應型均為0～1級，表現(xiàn)為免疫或高抗；感病對照銘賢169和輝縣紅的反應型為4級，表現(xiàn)為高感；CS、7M附加系和7M(7A)代換系的反應型為3～4級，表現(xiàn)為中感或高感；1003對CYR29、CYR31和CYR32的反應型為3～4級，表現(xiàn)為中感或高感，但對CYR23的反應型為0級，表現(xiàn)為免疫。這表明1003攜帶有針對條銹生理小種CYR23的垂直抗性基因，抗性基因來源于卵穗山羊草SY159。

2.6 農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果(表3，圖8)表明，1003的小穗粒數(shù)、小穗數(shù)和千粒重與親本CS沒有顯著差異；其株高、小穗數(shù)、分蘗數(shù)和千粒重與親本卵穗山羊草SY159存在顯著差異(P<0.05)；株高與7M附加系或7M(7A)代換系存在顯著差異(P<0.05)?？傊?，1003是一個綜合農(nóng)藝性狀介于CS和SY159兩親本之間、千粒重較高、性狀穩(wěn)定的育種材料。

A:中國春;B:1003;C:7M附加系;D:7M(7A)代換系;紅色為Oligo-pTa535探針，綠色為Oligo-pSc119.2探針；白色箭頭所指為小麥的4A和5A染色體，黃色箭頭所指為卵穗山羊草SY159的7M染色體。

A:CS; B:1003; C:7M additional lines; D:7M(7A) substitution lines.Red is the Oligo-pTa535 probe and green is the Oligo-pSc119.2 probe;The white arrows refer to the 4A and 5A chromosomes of wheat,and the yellow arrows refer to the 7M chromosome of theAe.geniculateRoth SY159.

圖4 中國春、1003、7M附加系和7M(7A)代換系的根尖細胞FISH分析結(jié)果

Fig.4 FISH analysis results in root tip cells of CS,1003,7M additional line and 7M(7A) substitution line

A:以Oligo-44(紅色)為探針對1003進行ND-FISH分析，B:以Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)為探針對1003進行FISH分析；白色箭頭所指為5A染色體。

A:ND-FISH analysis of 1003 with Oligo-44(red);B:FISH analysis of 1003 with Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green). The white arrows refer to the 5A chromosome.

圖5 1003中特定染色體的非變性熒光原位雜交(ND-FISH)分析

Fig.5 Non-denatured fluorescenceinsituhybridization(ND-FISH) analysis of specific chromosomes in 1003

1:陜優(yōu)225(對照);2:中國春;3:卵穗山羊草SY159;4:1003;5:7M附加系;6:7M(7A)代換系。

1:Shanyou 225(CK);2:CS;3:Ae.geniculataRoth SY159;4:1003;5:7M addition line;6:7M(7A) substitution line.

圖6 不同材料的苗期白粉病抗性表現(xiàn)

Fig.6Resistance to powdery mildew in differentmaterials at seedling stage

1:銘賢169(對照);2:中國春;3:卵穗山羊草SY159;4:1003;5:7M附加系;6:7M(7A)代換系。

1:Mingxian 169(CK); 2:CS; 3:Ae.geniculataRoth SY159;4:1003; 5:7M addition line; 6:7M(7A) substitution line.

圖7 不同材料苗期對條銹菌生理小種CYR23的抗性表現(xiàn)

Fig.7Resistance of different species at seedling stage tophysiological race CYR23 of stripe rust

表2 不同材料苗期對4個條銹菌生理小種的抗性反應Table 2 Resistant response of different materials at seedling stage to four physiological races of stripe rust

-：沒有數(shù)據(jù)。 -: No data.

表3 1003及其親本和7M附加系、7M(7A)代換系的農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of 1003 and its parents,7M additional line,and 7M(7A) substitution line

同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示不同材料間差異在0.05水平上顯著。

Different lower-case letters within same column indicate significant difference between different materials at 0.05 level.

3 討 論

3.1 1003中FISH信號的變異

染色體重排在植物進化中扮演著重要角色。Badaeva等[22]調(diào)查了208個四倍體和252個六倍體小麥種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)70(33.7%)個四倍體和69 (27.4%)個六倍體中存在染色體重排。Huang等[23]使用多個基于重復序列的寡核苷酸探針，通過FISH技術(shù)比較CS和373個中國品種的高分辨率核型，發(fā)現(xiàn)148(39.7%)個品種發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，鑒別出167個具有多態(tài)性染色體區(qū)域，表明廣泛種植的小麥品種與其親本的染色體結(jié)構(gòu)重排和多態(tài)性頻繁發(fā)生。在本研究中，1003中4A和5A的FISH信號與CS中4A和5A的FISH信號不一致，4A長臂頂端的綠色信號丟失，5A長臂中間的紅色信號丟失，并且在相應的位置獲得了綠色信號，這種改變可能是由于小麥染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)重排引起的，也可能是由于FISH信號的多態(tài)性引起的。1003中7M的FISH信號與同遺傳背景的7M附加系、7M(7A)代換系中7M的FISH信號相比發(fā)生了改變，1003中的7M染色體長臂上的紅色信號大部分丟失，鑒于1003、7M附加系和7M(7A)代換系對白粉病的反應型一致，推測1003中7M的FISH信號的改變并非是由重排引起的，而是FISH信號多態(tài)性的一種形式。

1:中國春;2:卵穗山羊草SY159;3:1003;4:7M附加系;5:7M(7A)代換系。

1:CS;2:Ae.geniculataRoth SY159;3:1003; 4:7M addition line;5:7M(7A) substitution line.

圖8 1003與其親本的形態(tài)性狀比較

Fig.8 Comparison of agronomic traits between 1003 and its parents

3.2 1003抗病基因的來源

山羊草屬與小麥的遺傳關(guān)系最近[24]，山羊草屬物種染色體組與小麥染色體組的同源程度高，因此向小麥中轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)比較容易。Cifuentes等[25]的研究表明，部分同源配對在小麥和山羊草的遠緣雜交中廣泛存在。王玉海等[26]鑒定出高抗白粉的漸滲系新種質(zhì)TA002，并推測偏凸山羊草或柱穗山羊草的遺傳物質(zhì)是通過同源重組的途徑以小片段漸滲的形式實現(xiàn)基因重組的。在本研究中，1003攜帶1對7M外源染色體，與同攜帶7M外源染色體的7M附加系和7M(7A)代換系對白粉菌生理小種E09的反應型一致，均為免疫，證明在7M染色體上攜帶著白粉病抗性基因；1003、7M附加系和7M(7A)代換系對條銹菌生理小種CYR29、CYR31和CYR32的反應型一致，均為中感至高感，表明7M染色體上未攜帶針對這3個生理小種的條銹病抗性基因；1003、7M附加系和7M(7A)代換系對條銹菌生理小種CYR23的反應型不一致，1003表現(xiàn)為免疫，7M附加系和7M(7A)代換系均表現(xiàn)為高感，推測1003中攜帶的針對條銹生理小種CYR23的抗性基因并不來源于7M染色體，鑒于1003的小麥親本CS對條銹生理小種CYR23表現(xiàn)為高感，親本卵穗山羊草SY159對條銹生理小種CYR23表現(xiàn)為高抗，故1003攜帶的針對條銹生理小種CYR23的抗性基因來源于親本卵穗山羊草SY159，1003除攜帶外源染色體7M外，有可能滲入卵穗山羊草SY159其他染色體的小片段，這還有待于進一步研究證明。