王警 張雪寒 郭蕓蕓 張碧成 吳慶俠 何孔旺

摘要：試驗(yàn)針對產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌SLT-IIe初步建立一種豬水腫病大腸桿菌的血清學(xué)檢測方法。通過原核表達(dá)構(gòu)建出重組崖pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21在IPTG誘導(dǎo)下獲得表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式產(chǎn)生，使用十二烷基肌氨酸鈉（SKL）變性的生化提純步驟獲取有生物學(xué)活性的重組蛋白。將提取的SLT-He蛋白作為抗原包被ELISA板，初步建立了特異性強(qiáng)的豬水腫病診斷方法，方陣滴定確定抗原最佳包被濃度為2μg/孔，最佳血清稀釋濃度是1：25，HRP-羊抗豬二抗的工作濃度1：15000，5%脫脂奶封閉1h，顯色15min。該方法的建立對豬水腫病流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制該病的發(fā)生有重要意義。

關(guān)鍵詞：豬水腫病;產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌;SLT-IIe;ELISA

中圖分類號：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.08.003

0 引言

豬水腫病是仔豬的一種急性致死性傳染病，主要由O138、O139等血清型產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌引起的腸毒血癥[1]，主要發(fā)生于斷奶仔豬。發(fā)病率通常為10%～35%，病死率高達(dá)90%[2]。類志賀毒素Ⅱ型變異體（SLT-IIe）又稱豬水腫毒素，是豬水腫病的重要致病因子[3]，其分子結(jié)構(gòu)由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成[4]。

產(chǎn)SLT-IIe大腸桿菌的傳統(tǒng)診斷方法是用Vero細(xì)胞和小鼠神經(jīng)毒性試驗(yàn)，并以抗SLT-IIe血清或單克隆抗體做中和試驗(yàn)鑒定，但診斷程序比較繁瑣。以SLT-IIe特異性抗體為診斷試劑的ELISA具有高度的特異性[5]。試驗(yàn)通過原核表達(dá)SLT-IIe重組蛋白，并以此作為包被抗原建立同時(shí)檢測SLT-IIe抗體的間接ELISA方法，研制檢測SLT的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清

原核表達(dá)載體pET28a-sumo（帶有11.2kD的sumo標(biāo)簽）、IPTG、豬SLTEC標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;Sac-1與Bsa-1購自BioLabs;辣根過氧物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬IgG購自BETHYL。

1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)和提取

參考Gen Bank上公布的SLT-IIe基因序列（登錄號：M21534）設(shè)計(jì)特異性引物，大小為219bp。將SLT-IIe基因雙酶切后克隆入pET28a-sumo載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

陽性重組菌OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12h后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定表達(dá)情況。將菌液離心后的沉淀裂解后用20% SKL貯存液提取SLT-IIe重組蛋白。

1.3 間接ELISA檢測方法

用pH為9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白以4μg/孔、2μg/孔倍比稀釋至0.03125μg/孔后，每孔100μL包被酶標(biāo)板，血清從1：25、1：50倍比稀釋至1：12800進(jìn)行矩陣滴定;二抗1：15000稀釋，用TMB顯色，2mol/L的H₂SO₄終止反應(yīng)測定OD_450nm值。選擇陽性O(shè)D大于1，陰性O(shè)D介于0.1～0.2，P/N值最大時(shí)的抗原濃度和血清稀釋度。在此基礎(chǔ)上分別對酶標(biāo)二抗的工作濃度、封閉液種類、封閉時(shí)間等逐優(yōu)化。計(jì)算10份未感染SLT-IIe的陰性豬血清與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD_450nm的比值S/P以及其平均值X及標(biāo)準(zhǔn)方差SD，陰陽性臨界值=X+3SD作為EMSA判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 特異性試驗(yàn)

按已建立的間接ELISA方法操作，分別檢測已知PEDV、TGEV、FMDV、O157：H7和大腸桿菌F4和F5陽性血清，每份血清做2個(gè)重復(fù)。用酶標(biāo)儀測定各孔OD_450nm值，確定該間接ELISA方法的特異性。

1.5 臨床樣品檢測

檢測實(shí)驗(yàn)室保存的不同日齡未免疫豬水腫病疫苗的豬血清共409份，其中新生未吃初乳的仔豬血清10份、2周齡30份、3周齡67份、4周齡35份、5周齡50份、6周齡及以上周齡母豬血清共206份。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與重組蛋白的表達(dá)

重組崖pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白獲得高效表達(dá)，分子量大小約為25kD，條帶單一，見圖1。

2.2 間接ELISA方法的建立

經(jīng)方陣滴定法確定并優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件：包被抗原濃度為2ug/孔，血清稀釋度為1：25;酶標(biāo)二抗的稀釋度為1：15000，封閉時(shí)間為1h，底物最佳反應(yīng)時(shí)間為15min。經(jīng)計(jì)算，10份血清的S/P平均值X=0.140，SD=0.0330，因此ELISA陰陽性臨界值為X+3SD=0.239。

2.3 特異性試驗(yàn)

檢測已知的PEDV、TGEV、FMDV、O157、F4和F5的陽性血清S/P值均小于0.239，判定為陰性，表明該方法具有良好的特異性，見表1。

2.4 臨床豬血清檢測

檢測本實(shí)驗(yàn)室保存的不同日齡豬血清409份結(jié)果顯示，新生仔豬陽性率為0，2周齡陽性率達(dá)83.33%，此后的陽性率呈逐步上升趨勢，5周齡的增幅相對較高。新生未吃初乳仔豬幾乎不發(fā)病，但2周齡的豬陽性率顯著增高，呈現(xiàn)出大面積流行和爆發(fā)，分析其原因可能是該豬場存在環(huán)境的污染和帶菌豬的廣泛傳播;5周齡陽性率偏高，據(jù)了解該豬場生豬在5周齡斷奶，可能導(dǎo)致了陽性率的升高，這與豬水腫病的流行病學(xué)規(guī)律一致。

3 討論與結(jié)論

近年，SLT-IIe大腸桿菌LAMP檢測方法的建立及被初步應(yīng)用[6]，Craig S[7]開發(fā)并鑒定了4種針對SLT-IIe的單克隆抗體，使用這些單抗對SLT-IIe的檢測限為11.8pg/mL，這些免疫學(xué)方法的建立比較耗時(shí)且成本較高。研究中建立的間接ELISA方法成本低，可以檢測血清中的IgG抗體。

研究通過SLT-He基因的克隆和原核表達(dá)，用SLT-IIe表達(dá)蛋白作為包被抗原，采用方陣滴定方法確定抗原的最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)，優(yōu)化了各項(xiàng)反應(yīng)條件。利用建立的SLT-IIeELISA診斷方法對409份本實(shí)驗(yàn)室保存的不同日齡未免疫豬水腫病疫苗的豬血清進(jìn)行檢測，未吃初乳的小豬陽性率為。，2周齡的仔豬呈現(xiàn)爆發(fā)性流行，分析其原因這可能是由臨床環(huán)境引起，豬水腫病的傳染源來自病豬和帶菌仔豬，其糞便會(huì)排出大量的致病性大腸桿菌。作為一種條件性致病菌，在一定條件下，攜帶有SLT-IIe毒素蛋白的大腸桿菌在豬舍間廣泛傳播，導(dǎo)致豬場環(huán)境被污染，進(jìn)而造成豬水腫病的爆發(fā)和地方流行。研究中建立的SLT-IIeELISA診斷方法可以有效的檢測豬場中SLT-IIe的攜帶和感染狀況，陽性率高低能反應(yīng)豬群的實(shí)際感染情況，對豬水腫病流行病學(xué)調(diào)查以及控制該病的發(fā)生十分重要。

參考文獻(xiàn)

[1]孫海清.Stx2e毒素酶活性位點(diǎn)突變體毒素生物學(xué)特性及免疫保護(hù)性的研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2013.

[2]Moxtey R A.Veterinary Clinics of North America Food AnimalPractice[J].Edema disease，2000，16（1）：175-185.

[3]楊明柳.致豬水腫病大腸桿菌二重PCR檢測方法及三價(jià)滅活菌苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4]林藝遠(yuǎn).致豬水腫病大腸桿菌ELISA抗體檢測方法及基因工程亞單位疫苗的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[5]張強(qiáng)，張雪寒，何孔旺，等.ETEC F4-F5融合基因表達(dá)及間接ELISA方法建立[J]中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（8）：1312-1317.

[6]丁建民，江馗語，朱江巍，等.致豬水腫病主要毒力因子-產(chǎn)志賀毒素Ⅱ型變異體大腸桿菌LAMP檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].農(nóng)家致富顧問，2017（16）：35-38.

[7]Craig S，Stephanie P，Hernlem B J，et al.New Stx2eMonoclonal Antibodies for Immunological Detection andDistinction of Stx2 Subtypes[J].PLOS ONE，2015，10（7）：e0132419.

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2017341-1）

作者簡介：王警（1993-），女，碩士研究生，主要從事食源性病原菌分離、鑒定和遺傳進(jìn)化分析工作。

通信作者：吳慶俠，副教授，從事家畜生殖內(nèi)分泌與生殖免疫研究。

何孔旺，研究員，從事人獸共患病防控技術(shù)和致病機(jī)制研究。