楊雪鵬 周留柱 馬科 崔君竹 葉建斌

摘要：研究了不同質(zhì)量濃度（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）的吡咯喹啉醌（PQQ）對(duì)水芹種子萌發(fā)過程的影響，結(jié)果表明：在PQQ的作用下，水芹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和呼吸強(qiáng)度均隨著PQQ質(zhì)量濃度的增加而提高，其中質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ浸種效果最佳，PQQ具有促進(jìn)水芹種子萌發(fā)的生理效應(yīng);PQQ的作用對(duì)水芹種子中淀粉酶活力影響不大，對(duì)脂肪酶和過氧化物酶活力有著明顯的增強(qiáng)作用.

Abstract：The effects of pyrroloquinoline quinone （PQQ） at different mass concentrations （4 μg/mL， 8 μg/mL， 12 μg/mL and 16 μg/mL） on the germination process of cress seeds were studied. The results showed that the germination rate， the germination potential， the germination index and the respiration rate of cress seeds increased with PQQs concentration. The PQQ had the best seed soaking effect when the concentration was 16 μg/mL. The PQQ could promote the germination of cress seeds. The PQQ had little effect on the amylase activity in cress seeds， and it had a significant enhancement effect on lipase and peroxidase enzyme activities.

關(guān)鍵詞：吡咯喹啉醌;水芹;種子萌發(fā);生理效應(yīng)

Key words：pyrroloquinoline quinone;cress;seed germination;physiological effect

中圖分類號(hào)：Q569;TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.04.001

文章編號(hào)：2096-1553（2019）04-0001-07

0 引言

1960年代，一種新型維生素吡咯喹啉醌PQQ（pyrroloquinoline quinone）被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，它廣泛存在于水果、蔬菜、谷物等食品中，是許多細(xì)菌中甲醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶GDH（glucosedehydrogenase）、甘油脫氫酶等的輔酶，能夠參與呼吸鏈電子傳遞[1-2].但是，只有部分革蘭氏陰性菌能夠自身合成PQQ，而人類與動(dòng)植物主要從外界獲取該維生素[3-4].

研究表明，PQQ可以縮短植物生長停滯期，促進(jìn)植物細(xì)胞新陳代謝和生長[5].

張鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥植株生理代謝調(diào)節(jié)過程中，PQQ可增加葉綠素含量，使光合速率增加，并提高硝酸還原酶和谷氨轉(zhuǎn)氨酶活性，從而減少穗部小花敗育，提高小麥結(jié)實(shí)率.

匡煒等[7]的研究表明，PQQ能有效提高湘早秈45號(hào)水稻的每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率，減少每穗空粒數(shù)，對(duì)水稻增產(chǎn)有促進(jìn)作用.另外，PQQ作為GDH

的氧化還原輔因子，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，溶解不溶性磷酸鹽到土壤中，促進(jìn)植物吸收生長[8].PQQ還可以促進(jìn)玫瑰紅蘋果和紅富士蘋果花粉萌發(fā)和花粉管生長，但濃度過高則會(huì)減弱效果，甚至產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且紅富士蘋果較玫瑰紅蘋果更為敏感，當(dāng)PQQ濃度高于1 μmol/L時(shí)即產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)[9].

總之，PQQ能促進(jìn)某些植物生長，但其對(duì)水芹種子的萌發(fā)過程是否有影響尚不明確.本文擬以水芹種子為原料，研究不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的影響，并進(jìn)一步研究PQQ的作用對(duì)種子萌發(fā)過程中關(guān)鍵酶（淀粉酶、脂肪酶和過氧化物酶）活性的影響，以明晰PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的生理效應(yīng)和作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：水芹種子，購于鄭州市種子公司;吡咯喹啉醌（色譜純），由瀚香生物科技公司提供.

實(shí)驗(yàn)試劑：3，5-二硝基水楊酸、甲苯、乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);愈創(chuàng)木酚，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn);橄欖油、乙醚，生工生物工程上海股份有限公司產(chǎn);百里香酚酞，廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司產(chǎn);SHP-250型恒溫光照培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn);2300型UV-分光光度計(jì)，尤尼克（上海）有限公司產(chǎn);Sartorius PB-10型pH酸度計(jì)，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水芹種子萌發(fā)

取大小均勻的水芹種子，將其分為5組，每組20粒.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的NaClO浸種20 min，蒸餾水洗凈，再用不同質(zhì)量濃度的PQQ（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）室溫浸種48 h，用3 mL不同質(zhì)量濃度的PQQ溶液浸潤濾紙，并將種子點(diǎn)播吸附在濾紙上，置于恒溫培養(yǎng)箱中于25 ℃下光照培養(yǎng).其間補(bǔ)加相應(yīng)質(zhì)量濃度的PQQ以保持濾紙的濕潤[10].實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 d，每d記錄正常發(fā)芽種子數(shù).按以下公式計(jì)算水芹種子的各種活力指標(biāo).

發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)供實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100%

1.3.2 呼吸強(qiáng)度測定

呼吸強(qiáng)度，是植物體新陳代謝強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，它是指單位面積或單位質(zhì)量的植物體，在單位時(shí)間內(nèi)所吸收的O2或釋放的CO2量或損失的干重.

用飽和堿液吸收一定量的植物材料在單位時(shí)間內(nèi)放出的CO2，再用標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定，即能測得植物的呼吸強(qiáng)度.

參照李海霞等[11]的方法，用上述不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)種子進(jìn)行浸種處理，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 5 d，每d對(duì)呼吸速率進(jìn)行測定，然后按以下公式計(jì)算呼吸強(qiáng)度.

其中，V0為空白滴定用去的草酸量/mL，V1為樣品滴定用去的草酸量/mL，W為樣品鮮重/g，T為測定時(shí)間/h.

1.3.3 酶活力測定

1.3.3.1 淀粉酶活力測定

參照張志鵬[12]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸還原法，每12 h對(duì)不同質(zhì)量濃度PQQ浸種處理的水芹種子中淀粉酶活性進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d。酶活力定義為每g樣品在單位時(shí)間內(nèi)生成還原糖（麥芽糖）的量.

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別配制0 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL 和1.0 mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于刻度試管中，加3.0 mL 二硝基水楊酸（DNS）試劑，搖勻，沸水浴10 min后經(jīng)流水冷卻，加蒸餾水定容至15 mL，在520 nm 的波長下比色測定吸光度值，并建立通過吸光度值求麥芽糖質(zhì)量濃度的回歸方程.

淀粉酶液制備：稱取1 g經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ溶液作用的水芹種子于研缽中，加入5 mL蒸餾水，研磨勻漿后倒入離心管中，再用10 mL蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管.在室溫下靜置 20 min 制備提取液，每隔5 min攪動(dòng)1次，使其充分提取.在4 ℃條件下3000 r/min低溫離心10 min，取上清液加蒸餾水定容至100 mL后搖勻，即為淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力測定.取淀粉酶原液10 mL，用蒸餾水定容至 50 mL 后搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶活力的測定.

1.3.3.2 脂肪酶活力測定

脂肪酶可以分解種子中貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)，為種子萌發(fā)的異養(yǎng)階段提供能量[13].

參照GB/T 5523—2008[14]，稱取2 g水芹種子于研缽中，加入1.0 mL橄欖油，混勻，加入5.0 mL pH=7.5的磷酸緩沖液，研磨后轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，用5.0 mL蒸餾水洗凈研缽，洗液全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加3滴甲苯，置于30 ℃恒溫箱內(nèi)，保溫24 h后取出.加入V（乙醇）GA6FAV（乙醚）=4GA6FA1的混合液50 mL，靜置5 min，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的百里香酚酞乙醇溶液指示劑，用0.2 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液滴定至終點(diǎn)（淺藍(lán)色），記錄用去堿液的體積（V2）.另外稱取2 g相應(yīng)質(zhì)量濃度試樣做對(duì)照試驗(yàn)，除不用 30 ℃ 保溫24 h外，其余操作同上，記下用去的堿液體積（V3）.

每12 h對(duì)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子進(jìn)行脂肪酶活性測定，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 3 d.

其中，V2為試樣滴定用去的堿液體積/mL，V3為對(duì)照試驗(yàn)用去的堿液體積/mL，N為實(shí)際堿液質(zhì)量濃度/（mol·L-1），W1為試樣質(zhì)量/g，M為試樣水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%.

1.3.3.3 過氧化物酶活力測定

過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，與呼吸作用、光合作用、生長素的氧化等都有關(guān)系[15].

分別取0.5 g經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子于研缽中，加入液氮后充分研磨，再加入3.0 mL磷酸緩沖液，預(yù)冷5 min，7000 r/min 離心15 min，上清液為粗酶提取液，提取后低溫保存待用.

酶活力測定的反應(yīng)體系為：0.05 mol/L磷酸緩沖液2.9 mL;2%的H2O2 1.0 mL;0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚 1.0 mL;酶液0.1 mL.用加熱煮沸5 min的酶液作為對(duì)照.反應(yīng)體系加入酶液后，立即于34 ℃水浴保溫30 s，在 470 nm 波長處進(jìn)行比色，開始記錄數(shù)據(jù)，然后每 0.5 min 記錄一次吸光度值，共測2 min.

以每min A470的變化值0.01為一個(gè)相對(duì)酶活單位U，計(jì)算植物組織內(nèi)過氧化物酶活力的大小.每12 h對(duì)經(jīng)不同質(zhì)量濃度PQQ作用的水芹種子進(jìn)行過氧化物酶活力測定，實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d.

其中，Vt為酶液的總體積/mL，ΔA470為吸光度的變化值，t為間隔時(shí)間/min，Vs為測定時(shí)取用的酶液體積/mL，W2為粒種子的質(zhì)量/g.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的影響

水芹種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，以胚根突破種皮1 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)（圖1a）），萌發(fā)初期（即培養(yǎng)期的前96 h）組間差異不明顯，水芹種子基本不發(fā)芽或者剛剛露白（圖1b））.圖2為中后期水芹種子萌發(fā)情況.由圖2可知，在4種質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PQQ質(zhì)量濃度越高，對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用越明顯.在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下，種子萌發(fā)到120 h時(shí)的發(fā)芽率為43.4%，對(duì)照組發(fā)芽率為33%;至192 h時(shí)的發(fā)芽率提升至85%，對(duì)照組發(fā)芽率為42.6%.在其他3種質(zhì)量濃度的PQQ作用下的水芹種子的發(fā)芽率均高于對(duì)照組，低于在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的發(fā)芽率.由此可見PQQ能有效促進(jìn)水芹種子的萌發(fā).

在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下水芹種子的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽勢如圖3和圖4所示.由圖3和圖4可知，水芹種子在萌發(fā)的第 8 d，對(duì)照組的發(fā)芽率為56.7%，在質(zhì)量濃度為 8 μg/mL 的PQQ作用下的種子發(fā)芽率為70%;在質(zhì)量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的種子發(fā)芽率最高，為86.7%.以萌發(fā)第5 d計(jì)算發(fā)芽勢，在質(zhì)量濃度為0～16 μg/mL的PQQ作用下，種子的發(fā)芽勢從33.3%提高到43.3%.這表明隨著PQQ質(zhì)量濃度的提高，水芹種子發(fā)芽勢逐漸增大，種子活力提高，發(fā)芽率隨之提高.

2.2 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子呼吸強(qiáng)度的影響

在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下水芹種子的呼吸強(qiáng)度如圖5所示.由圖5可知，在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下的水芹種子呼吸強(qiáng)度變化趨勢基本一致，表明浸種過程中水芹種子的生理變化正常.在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下的水芹種子，其萌發(fā)過程中呼吸強(qiáng)度始終高于對(duì)照組，其中經(jīng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 的PQQ作用的種子呼吸強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)間段均最高.在水芹種子萌發(fā) 120 h 后，經(jīng)質(zhì)量濃度為 0～16 μg/mL 的PQQ作用的種子呼吸強(qiáng)度由 0.347 mL·g-1·h-1 提升到 0.400 mL·g-1·h-1.

2.3 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子關(guān)鍵酶活性的影響

2.3.1 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子淀粉酶活力的影響

通過測定不同質(zhì)量濃度的麥芽糖溶液在 520 nm 波長下的吸光度值，建立的回歸方程為y=0.834 1x+0.020 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999.所得麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6.

在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下的水芹種子淀粉酶活力如圖7所示.

由圖7可知，水芹種子經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的PQQ作用后，其淀粉酶活力變化不大且無明顯差異，不同質(zhì)量濃度在不同時(shí)期的測定結(jié)果也無顯著差異，淀粉酶活力在152.1～161.0 mg·g-1·min-1之間，表明PQQ對(duì)水芹種子淀粉酶活力影響不大.

2.3.2 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子脂肪酶活力的影響

在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下水芹種子脂肪酶活力如圖8所示.由圖8可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的PQQ的作用，水芹種子隨著萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)，脂肪酶活力與對(duì)照組有較大的差異，且隨著PQQ質(zhì)量濃度的增加，促進(jìn)作用更加明顯.

經(jīng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL的 PQQ作用的水芹種子，在種子萌發(fā)的第 36 h，其脂肪酶活力為0.71 mol/g，對(duì)照組脂肪酶活力為0.4 mol/g;在第60 h，其脂肪酶活力為0.9 mol/g，對(duì)照組脂肪酶活力為0.6 mol/g;在第72 h，其脂肪酶活力為0.85 mol/g，對(duì)照組脂肪酶活力為0.35 mol/g.

在質(zhì)量濃度4 μg/mL，8 μg/mL的PQQ作用下脂肪酶活力變化與在質(zhì)量濃度16 μg/mL的PQQ作用下的趨勢相同，且均低于在質(zhì)量濃度16 μg/mL的PQQ作用下的種子脂肪酶活力.不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下的種子酶活力比對(duì)照組均有明顯提升，表明PQQ能促進(jìn)水芹種子脂肪酶活力的增強(qiáng).

2.3.3 不同質(zhì)量濃度的PQQ對(duì)水芹種子過氧化物酶活力的影響

在不同質(zhì)量濃度的PQQ作用下水芹種子過氧化物酶活力如圖9所示.由圖9可知，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的PQQ作用后，水芹種子的過氧化物酶活力均有所提高.

經(jīng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 的PQQ作用的水芹種子，在種子萌發(fā)的第24 h，其過氧化物酶活力為7.2 U，而對(duì)照組過氧化物酶活力為5.2 U;在24～48 h過程中，其過氧化物酶活力迅速變大，至48 h時(shí)，其過氧化物酶活力為11.3 U，而對(duì)照組過氧化物酶活力為4.4 U;

48 h后酶活力提升減緩，經(jīng)其他質(zhì)量濃度的PQQ處理的種子過氧化物酶活力變化趨勢也基本相同.其原因可能是PQQ能夠參與呼吸鏈電子傳遞，由此促進(jìn)了過氧化物酶活力的提高，進(jìn)而加快了水芹種子萌發(fā).

3 結(jié)論

本文研究了4種質(zhì)量濃度（4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL）的PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)過程中發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、呼吸強(qiáng)度和關(guān)鍵酶（淀粉酶、脂肪酶和過氧化物酶）活力的影響.結(jié)果表明，PQQ可以促進(jìn)水芹種子萌發(fā)，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和呼吸強(qiáng)度均隨著PQQ質(zhì)量濃度的增加而提高，其中，質(zhì)量濃度為16 μg/mL 的PQQ浸種效果最佳;PQQ對(duì)水芹種子中淀粉酶活力影響不大，對(duì)脂肪酶和過氧化物酶活力有著明顯的增強(qiáng)作用，表明PQQ促進(jìn)水芹種子萌發(fā)的機(jī)制可能是通過增強(qiáng)水芹種子萌發(fā)過程中脂肪酶和過氧化物酶活力而實(shí)現(xiàn)的.

該研究初步探索了PQQ對(duì)水芹種子萌發(fā)的生理效應(yīng)，證實(shí)了PQQ的作用可以促進(jìn)水芹種子的萌發(fā)，接下來仍需就PQQ提高水芹種子關(guān)鍵酶活力的影響途徑作進(jìn)一步研究，以期為開發(fā)PQQ成為生物復(fù)合肥中的功能組分提供理論參考.

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