馮 星 葉 紅 胡元波 湯佳楠 王志凱 孫予華 顧一驊 鄭菊芬,,**

1.上海市計生所醫(yī)院檢驗(yàn)科（上海 200032）

2.上海市計劃生育科學(xué)研究所，國家人口和計劃生育避孕藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 200032）

3.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心（上海 200433）

前 言

男性不育癥發(fā)病率高，然而病因大多都不明確[1]，單精子卵胞漿內(nèi)注射技術(shù) （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的發(fā)明給男性不育癥的治療帶來重大突破，但由于受精過程是將精子直接注射入卵子，因而無法觀察到精子的自然受精結(jié)果，也就不能解決病因和診斷等問題。ICSI技術(shù)是無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥等嚴(yán)重男性不育癥的首選治療方法，但更多其他不育癥希望能自然生育，其前提則是精子必須具備自然受精能力，所以，尋找有效的精子功能試驗(yàn)來輔助判斷不同類型精子的受精能力是生殖男科重要的研究方向。常規(guī)體外受精技術(shù)（in vitro fertilization，IVF）雖然是用來治療輸卵管阻塞等女性不孕癥問題，但由于能在體外直接觀察到精子的受精結(jié)果，因而可以用來驗(yàn)證精子功能試驗(yàn)對受精能力的預(yù)測作用；特別時近年來使用的短時IVF[2]治療既能觀察到精子的受精結(jié)果，又能避免因完全不受精或低受精等對患者夫婦帶來不良結(jié)果的倫理問題，為各項(xiàng)精子功能試驗(yàn)提供了操作性強(qiáng)又準(zhǔn)確的臨床驗(yàn)證方法。

頂體酶是位于精子頭部的頂體內(nèi)，是精子頭部穿過卵子透明帶完成受精過程中不可缺少的水解酶，也是自然受精的必需步驟。不少研究[3，4]發(fā)現(xiàn)精子頂體酶活性與精子參數(shù)和受精能力存在顯著相關(guān)性，但精子參數(shù)受患者自身狀態(tài)、檢測設(shè)備型號和檢測人員經(jīng)驗(yàn)等諸多因素影響波動幅度較大[5-7]，而且診斷性檢測手段通常與IVF治療日會有幾個月甚至更長的時間差。為了將患者和技術(shù)等影響因素降到最低水平，本研究將懷孕率排除在外，這樣就可以減少對入組病例數(shù)量的要求以確保對每個IVF病例進(jìn)行全程狀態(tài)追蹤隨訪，并只對近期完成IVF治療的病例做頂體酶活性值測定，并利用體外受精結(jié)果來驗(yàn)證頂體酶活性值測定對不同參數(shù)精子受精能力判斷的準(zhǔn)確性，旨在為不同精子樣本尋找更合適的精子功能試驗(yàn)作為受精能力判斷的輔助診斷工具，以便讓患者選擇更合適的治療方式，減少人力和財力的浪費(fèi)。

材料與方法

一、研究對象和納入標(biāo)準(zhǔn)

（一）研究對象

2016年12月～2018年9月期間在上海計生所醫(yī)院門診做精子頂體酶活性測定并在長海醫(yī)院接受IVF或短時IVF治療的不育癥病例，共75例。

（二）納入標(biāo)準(zhǔn)

1.醫(yī)療依從性良好并準(zhǔn)備在近期接受IVF治療的不育癥病例：每次取精前全身狀態(tài)良好，禁欲時間3～5d，取精時標(biāo)本完整；在女方促排期間愿意接受并配合復(fù)查精液者；

2.精液分析結(jié)果入組標(biāo)準(zhǔn)：至少有兩次相近精液檢測結(jié)果，精液量≥1.0 mL，精子濃度≥10×106/mL，前向運(yùn)動精子百分率≥10%，精子正常形態(tài)率≥3%，精液中白細(xì)胞＜1×106/mL；

3.有IVF不受精或受精不良史病例優(yōu)先入組；

4.女方年齡小于40歲，成熟卵子數(shù)≥2個，病因?yàn)檩斅压芤蛩?、多囊卵巢綜合征或不明原因性不孕癥；

5.男女雙方染色體均正常。

二、研究方法

（一）男科臨床醫(yī)師全程隨訪

篩選入組病例并與之充分溝通，告知檢測意義及需要配合的注意事項(xiàng)；在女方配偶促排卵當(dāng)月對男方進(jìn)行頂體酶檢測，在IVF進(jìn)周期間保持全程跟蹤隨訪，并及時處理突發(fā)事件如感冒等其他意外狀況，盡量減少影響精子質(zhì)量的外在因素；當(dāng)頂體酶低于正常值或頂體酶值正常但精液參數(shù)處理前后不理想時給出短時IVF治療建議。由于本文通訊作者既是男科臨床醫(yī)生同時又參與胚胎實(shí)驗(yàn)室工作，有便利條件嚴(yán)格選擇入組病例并控制各項(xiàng)影響因素。

（二）精液分析

按照WHO第5版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液分析，禁欲2～7d之間采集精液，1h內(nèi)行精液常規(guī)分析，并由具備胚胎實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的男科臨床醫(yī)師同時做人工計數(shù)矯正；精子形態(tài)分析采用改良巴氏染色法進(jìn)行，計數(shù)不少于200個精子，并由胚胎實(shí)驗(yàn)室醫(yī)師復(fù)核。

（三）精子測定方法

采用Na-苯甲酰 -DL-精胺酸-P-硝?；桨?BAPNA)法進(jìn)行頂體酶活性測定[3]，使用天津瑞愛金生物科技有限公司的試劑盒和美譜達(dá)PV2的可見分光光度計。正常參考值為48.2～218.7 μIU/106個精子，低于48.2 μIU/106精子為低值。

頂體酶活性測定方法的質(zhì)量控制：（1）精子濃度計數(shù)雙人矯正；（2）傾倒精漿時要留意是否有精子的薄膜留在試管內(nèi)；（3）精子要充分與反應(yīng)液混勻,黏稠度高者需充分吹打；（4）反應(yīng)溫度要在24攝氏度水浴孵育；（5）臨用前配制反應(yīng)液，加完終止液離心后立即比色；（6）注意試劑批間差。

（四）IVF或短時IVF操作

采用控制性超排卵，以常規(guī)促性腺激素釋放激素（gonadotrophin-releasing hormone agonist,GnRHa）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）促排卵方案。常規(guī)IVF在取卵后3～4h將卵子加至制作好的受精滴中，加精后16～18h觀察受精情況。短時IVF在取卵后1～2h將卵子加至制作好的受精滴中，加精后4～6h觀察第二極體排出情況，當(dāng)天即對第二極體排出不明顯的卵子進(jìn)行ICSI注射操作，受精后16～18h觀察并記錄受精情況。為減少卵子成熟度對受精的影響，本研究受精率統(tǒng)計分母為成熟卵子數(shù)而非總獲卵數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

使用了SPSS 13.0軟件來分析所得到的數(shù)據(jù)，計數(shù)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢測，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

研究結(jié)果

一、一般臨床資料

本研究共納入IVF術(shù)前接受精子頂體酶活性測定病人 75 例，男方平均年齡（32.97±5.22）歲（25～51 歲），女方平均年齡（31.24±3.80）歲（23～39 歲），平均不育年限（3.80±2.31）年（0.5～11 年），其中男性繼發(fā)性不育 28例，女性繼發(fā)性不孕28例；不明原因原發(fā)性不育癥例12 例。 精液參數(shù)：精液量（2.58±1.02）mL（1.0～5.0）mL、精子濃度（48.74±31.37）× 106/mL[（12～172）× 106/mL]、前向運(yùn)動精子百分率（43.13±13.10）%(13～80%)、快速前向運(yùn)動精子百分率（19.67±6.93）%(5～42%)；除 4 例精子正常形態(tài)率在臨界狀態(tài)外，其余精子形態(tài)均正常。3例臨界形態(tài)精子處在頂體酶低值組，其中2例短時IVF不受精，1例IVF低受精；另外1例處在頂體酶正常值組，IVF受精率不到50%。由于有不良受精史和少弱精子癥病例優(yōu)先入組，所以總受精率較低為54.0%（343/635）,新鮮移植周期臨床妊娠率 52.6%(20/38)。

二、按頂體酶值分組的結(jié)果比較

按頂體酶活性值分類，低于48.2 μIU/106個精子為低值組，高于48.2 μIU/106個精子為正常值組：低值組和正常值組不明原因性不孕不育分別7例和5例。兩組的基本情況見表1，低值組男方年齡稍高于正常組（P＜0.01），兩組的頂體酶活性值和精子濃度有顯著差異（P＜0.01），但快速前向運(yùn)動精子百分率和前向運(yùn)動精子百分率均無顯著差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。頂體酶低值組的受精率顯著低于正常值組（P＜0.01），低受精病例明顯高于正常值組（P＜0.05），但完全不受精率僅比正常值組稍高 （P＞0.05）。正常值組完全不受精8例，卵子數(shù)均在6枚以上，沒有低受精病例，呈現(xiàn)“全”或“無”的受精模式；低值組完全不受精13例，只有4例卵子數(shù)6枚以上，另有低受精5例，見表2。

表1頂體酶正常值組和低值組的基本情況

表2頂體酶正常值組和低值組的臨床和實(shí)例數(shù)據(jù)比較

表3兩種不同精子濃度組的基本情況

三、按精子濃度分組的結(jié)果比較

兩組的基本情況見表3。按精子濃度分為低濃度組（10～35)×106/mL）和高濃度組（＞35 ×106/mL），兩組組的精子濃度和頂體酶活性值存在顯著性差異（P＜0.01），快速前向運(yùn)動精子百分率和前向運(yùn)動精子百分率也存在顯著性差異（P＜0.01）。精子低濃度組的受精率顯著低于高濃度組 （P＜0.01），低受精病例明顯高于高濃度組（P＜0.05），但完全不受精率比正常值組稍低，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低濃度組中完全不受精14例（其中5例卵子數(shù)6枚以上），低受精5例；頂體酶異常占80.56%（29/36），其中不受精和低受精率為58.62%(17/29)。高濃度組完全不受精7例（卵子數(shù)均在6枚以上），沒有低受精病例，呈現(xiàn)“全”或“無”的受精模式；頂體酶異常占12.8%（5/39），其中只有1例不受精，見表4。

表4兩種不同精子濃度組的臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

表5精子低濃度組中不同頂體酶組的基本情況

四、精子低濃度組再按頂體酶值分組結(jié)果比較

兩組的基本情況見表5。精子低濃度組和頂體酶低值組的不受精率和低受精比例明顯升高，特別是低受精情況更為顯著，在精子低濃度組再按頂體酶正常值組和低值組分組發(fā)現(xiàn)：兩組的精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率和快速前向運(yùn)動精子百分率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但頂體酶活性值和受精率存在顯著性差異（P＜0.01）：正常值組完全不受精2例，沒有低受精病例；低值組完全不受精12例，低受精5例，其差異均無顯著性（P＞0.05，見表 6）。

表6精子低濃度組中不同頂體酶組的臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

討 論

輔助生殖技術(shù)早期研究[8，9]就證實(shí)精子參數(shù)與受精結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)，而臨床妊娠結(jié)局不受精子參數(shù)影響，卻與女性配偶的年齡和生育狀態(tài)相關(guān)性更強(qiáng)，所以本研究排除懷孕率統(tǒng)計可以大大減少入組病例數(shù)，這樣更能集中精力做好IVF期間的隨訪追蹤和各項(xiàng)質(zhì)控工作，將研究重點(diǎn)關(guān)注在精子參數(shù)、頂體酶與受精能力的相關(guān)性上。頂體酶活性對IVF受精結(jié)果的影響一直存在著爭議，國內(nèi)大多研究[10，11]認(rèn)為頂體酶活性與精子體外受精能力密切相關(guān),頂體酶活性低下可能是導(dǎo)致受精失敗的原因。但國外雖然在早期對頂體酶研究較多，近年來卻有減少趨勢，可能因大多研究[12，13]認(rèn)為頂體酶活性與IVF受精結(jié)局無相關(guān)性，最近也有研究[14]認(rèn)為精子頂體功能與受精能力有一定的相關(guān)性，但敏感性和特異性均不高。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)推測這些不同結(jié)果可能與入組的精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)和精液的質(zhì)量控制體系密切相關(guān)，精子參數(shù)中形態(tài)學(xué)高畸形率影響頂體酶活性并導(dǎo)致受精能力下降的研究[15，16]結(jié)果較為一致，現(xiàn)行的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)[17]可以作為獨(dú)立的受精能力預(yù)測指標(biāo)，但最大的缺陷在于不同實(shí)驗(yàn)室和不同檢驗(yàn)人員的操作誤差相當(dāng)大，無法給出準(zhǔn)確可靠的診斷依據(jù)；我們前期研究顯示相似結(jié)果，所以本課題入組的大多為正常形態(tài)精子，只有4例精子形態(tài)學(xué)處于臨界狀態(tài)（3%），IVF受精結(jié)果都不理想：2例不受精，1例低受精，另1例受精率低于50%。同樣道理，我們選擇精子濃度≥10×106/mL，前向運(yùn)動精子百分率≥10%的病例入組，因?yàn)楸冗@些參數(shù)更差的精子選擇IVF治療后，其不受精或低受精病例的增多會顯著提高陽性結(jié)果，但對較好精子卻不一定有臨床意義；而嚴(yán)重少弱畸形精子癥精子由于自然受精能力極差，僅靠精液常規(guī)檢測和形態(tài)學(xué)即可決定是否需要接受ICSI技術(shù)治療，無需額外方法來輔佐。本課題對75例入組病例按頂體酶活性值分類，發(fā)現(xiàn)頂體酶低值組和正常值組的頂體酶活性值和精子濃度有顯著差異，但快速前向運(yùn)動精子百分率和前向運(yùn)動精子百分率均無顯著差異，該結(jié)果與少數(shù)研究[18]相一致；而大多研究[11，19]則認(rèn)為除了精子濃度和形態(tài)外，與前向運(yùn)動精子百分率也有顯著差異，這可能與本課題排除嚴(yán)重少弱精子癥入組有關(guān)。我們對精子濃度進(jìn)行統(tǒng)計處理發(fā)現(xiàn)35×106/mL可作為分界線，再細(xì)分為低濃度組[（10～35）×106/mL和高濃度組（＞35×106/mL），兩組的精子濃度和頂體酶活性值存在顯著性差異，快速前向運(yùn)動精子百分率和前向運(yùn)動精子百分率也存在顯著性差異。精子低濃度組的受精率顯著低于高濃度組，主要是低受精病例明顯多于高濃度組，但完全不受精病例僅比正常值組稍多無統(tǒng)計學(xué)意義，頂體酶異常占80.6%（29/36），其中不受精和低受精率為58.62%(17/29)；高濃度組精子頂體酶活性大多正常，出現(xiàn)“全”或“無”的受精模式，做頂體酶活性檢測無法預(yù)防完全不受精的發(fā)生，該現(xiàn)象提示高濃度組與低濃度組精子不受精的原因可能存在差異，需要用另外受精途徑研究解釋。將精子低濃度組再按頂體酶值分組，頂體酶低值組的受精率顯著低于頂體酶正常值組，而兩組的精子濃度、活動力和不受精率均無顯著性差異，這種情況提示了低濃度組的不受精或低受精可能與精子頂體酶活性下降直接相關(guān)；因而，對低濃度組精子有必要進(jìn)一步做頂體酶活性檢測，頂體酶低值者建議短時IVF治療，能有效減少甚至避免不受精和低受精病例的出現(xiàn)。

與大多數(shù)精子功能試驗(yàn)一樣，頂體酶活性值測定存在著因不同實(shí)驗(yàn)室的檢測方法和質(zhì)量控制體系不統(tǒng)一而導(dǎo)致結(jié)果可比性差的情況。為了加強(qiáng)質(zhì)控系統(tǒng)管理，本研究在頂體酶測定時間的選擇、患者精液檢測注意事項(xiàng)宣教、精子濃度準(zhǔn)確計數(shù)和頂體酶活性其他影響因素如精液中的白細(xì)胞水平[20]等各個環(huán)節(jié)都做了嚴(yán)格限定，但仍然不可避免存在患者依從性不一、精液檢測技術(shù)水平差異和頂體酶試劑批間差等問題。

本研究通過嚴(yán)格精液質(zhì)控和入組參數(shù)選擇后發(fā)現(xiàn)，精子濃度比活動力與頂體酶活性更具相關(guān)性；在低濃度組通常伴有頂體酶活性的下降，提示低受精或不受精可能性的增大，選擇短時IVF治療能有效降低受精失敗風(fēng)險；而高濃度精子頂體酶大多正常，同時呈現(xiàn)“全”或“無”的受精模式，其不受精原因可能與頂體酶活性無關(guān)，這類病例無需常規(guī)做頂體酶活性測定。