田翠，鐘英，陳光亮，趙耀，鄭海芳，劉霜，羅小嬌，張維娜，張強(qiáng)

（瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川瀘州646000）

四環(huán)素作為一種廣譜的抗生素，對(duì)于疾病的治療和預(yù)防都有良好的效果，常被用于飼養(yǎng)業(yè)、畜牧業(yè)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。長(zhǎng)期以來(lái)由于價(jià)格低廉、抗菌譜廣、使用方便等原因，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。然而一些不法商家和養(yǎng)殖戶為了獲得更大的利益濫用抗生素，不但不能被動(dòng)物吸收而以代謝產(chǎn)物排出體外對(duì)環(huán)境造成污染[1]，而且造成畜產(chǎn)品中抗生素嚴(yán)重超標(biāo)，從而進(jìn)入人體對(duì)身體造成傷害[2-5]。大量使用抗生素容易引起胃腸和肝臟的損害、致畸胎作用、二重感染，更嚴(yán)重的能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病。因此探究高效、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類抗生素的殘留對(duì)人類健康有著十分重要的意義。本文通過(guò)對(duì)比動(dòng)物源食品中四環(huán)素的三種檢測(cè)方法，農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號(hào)文件附錄8，GB/T 21237-2007，農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告-12-2008，以雞肉為例，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，且對(duì)部分實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)GB/T 21237-2007 的不僅實(shí)驗(yàn)操作方便且方法回收率較高，準(zhǔn)確性高，能較好的滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 四環(huán)素、金霉素、土霉素的標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)源于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；檸檬酸 (C6H8O7.H2O)、磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）、乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8.2H2O)、氫氧化鈉、濃氨水三氟乙酸均為分析純，甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，HLB 固相萃取柱60mg/3mL。高效液相色譜-質(zhì)譜為安捷倫三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀6460。

1.2 樣品的制備和貯存 取適量新鮮或冷凍的樣品中取出500g，用組織攪碎機(jī)充分?jǐn)囁榫鶆?，裝入潔凈的塑料瓶中，密封，并標(biāo)記，于-18℃以下冰凍存放。

1.3 樣品提取和凈化

1.3.1 農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]1 號(hào)文件附錄8 優(yōu)化后的方法提?。悍Q取1±0.02g 試樣于50mL 離心管中，加入Mclivaine-Na2EDTa （pH=5.0±0.2） 緩沖液8mL，渦動(dòng)1min，超聲20min，于-2℃1000r/min 離心10min，將上清液倒入另一50mL 離心管中，殘?jiān)尤肓姿猁}緩沖液8mL，同樣的方法提取一次，合并兩次提取液，混勻，備用。

凈化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取備用液過(guò)柱，依次用水5mL、20%的甲醇水溶液5mL 淋洗，減壓抽干5min，控制流速1mL/min。用15mL 洗脫液（乙酸乙酯：甲醇：濃氨水=150：150：6） 洗脫，并收集洗脫液，洗脫液于45℃水浴氮?dú)獯蹈?，用?fù)溶液（水：甲醇：乙腈：甲酸=40：5：5：0.05）1mL，渦動(dòng)1min溶解殘余物，14000r/min 離心6min，0.45um 濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.2 農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告-12-2008 雞肉、豬肉中四環(huán)素累藥物殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化后的方法

提?。悍Q取2±0.05g 試樣于50mL 離心管中，加入Mclivaine-Na2EDTA （pH=4.0±0.5） 緩沖液8mL，渦動(dòng)1min，-2℃8000r/min 離心10min，取上清液于另一50mL 離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，混勻，備用。

凈化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取備用液過(guò)柱，依次用水5mL、5%的甲醇水溶液5mL 淋洗，減壓抽干。用10mL 甲醇洗脫并收集洗脫液，于40℃水浴氮?dú)獯蹈桑眉状?水（3：7）1.0mL，渦動(dòng)溶解殘余物，0.45um 濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 GB/T 21317-2007 動(dòng)物源食品四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)方法，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法優(yōu)化后的方法

提?。悍Q取試樣5±0.01g 于50mL 離心管中，分別加入約18mL、18mL、12mLMclivaine-Na2EDTa（pH=4.0±0.05）緩沖液冰水浴超聲提取三次，每次渦動(dòng)混勻1min，超聲提取10min，合并上清液，并定容至50mL 混勻，-2℃5000r/min 離心10min，濾紙過(guò)濾，待凈化。

凈化：吸取10mL 提取液過(guò)固相萃取柱，待液體全部流出，依次用5mL 水和5mL 甲醇-水（1：19）淋洗，抽干5min，最后用15mL 甲醇-乙酸乙酯（1：9）洗脫。收集洗脫液，于40℃水浴氮?dú)獯蹈桑?.0mL 甲醇-三氟乙酸水溶液（1：19）溶解殘?jiān)?.45um 濾膜過(guò)濾，待測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別移取濃度為100ug/mL 四環(huán)素、金霉素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL 于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻，濃度均為5ug/mL，-20℃冰箱保存。

再移取2.00mL 濃度為5ug/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻，濃度為1ug/mL，-20℃冰箱保存。

1.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

選取不含四環(huán)素的空白組織樣品，經(jīng)過(guò)上述的提取凈化制備空白基質(zhì)液。分別添加混合濃度為1ug/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 ，0.01mL，0.02mL，0.04mL，0.08mL，0.10mL，0.20mL于空白基質(zhì)液中，并定容至1.00mL，配制成10.0ug/L，20.0ug/L，40.0ug/L，60.0ug/L，80.0ug/L，100.0ug/L，200.0ug/L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液體。

表1 液質(zhì)質(zhì)儀器條件

1.5 上機(jī)測(cè)試

將所前處理的溶液上高效液相色譜-質(zhì)譜為安捷倫三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀6460。儀器條件如下：

色譜柱：C18 50*2.1nm

流動(dòng)相：A：0.1%甲醇水溶液，B：0.1%甲酸甲醇溶液（梯度淋洗見(jiàn)表1）

柱溫：35℃；

流速：0.2mL/min；

進(jìn)樣量：2uL。

1.6 結(jié)果計(jì)算

采用外標(biāo)法定量，四環(huán)素類獸藥殘留量：X=L1*C*V/（L2*m）

X 樣品中帶測(cè)組份含量，單位為微克每千克(ug/kg)；

L1 樣品提取體積，單位為毫升(mL)；

L2 樣品移取體積，單位為毫升(mL)；

C 上機(jī)濃度測(cè)試濃度(ug/kg)；

m 稱取樣品的質(zhì)量（g）。

2 方法比對(duì)、回收率及原因分析

2.1 提取

表2 提取方法比對(duì)

2.2 凈化（三種方法所使用的均是HLB 固相萃取柱60mg/3mL）

表3 凈化方法比對(duì)

2.3 回收率

以加標(biāo)100ug/kg 為例，三種方法的回收率如下

表4 回收率

農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1號(hào)文件附錄8方法 在10-500ug/kg 的回收率為60%-110%，農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告-12-2008 方法在50-200ug/kg 的回收率為 60% -120% ，GB/T 21317-2007 在50-200ug/kg 的回收率為60%-120%；三種方法中四環(huán)素和土霉素的回收率都均能滿足實(shí)驗(yàn)要求，GB/T 21317-2007 較其它的方法回收率略高;金霉素的差別卻很大，只有GB/T 21317-2007 方法的的金霉素回收率在70%以上，綜上所述，測(cè)定雞肉中的四環(huán)素，只有GB/T 21317-2007 四環(huán)素、土霉素、金霉素回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 原因分析

GB/T 21317-2007 的方法較其他方法三個(gè)參數(shù)回收率都較高，主要是由于提取完后過(guò)濾，部分殘?jiān)陀椭瑲埩粼跒V紙上，凈化時(shí)不會(huì)堵塞固相萃取柱，以至于得到較高回收率。而其它兩個(gè)方法提取完直接過(guò)固相萃取柱，殘?jiān)陀椭菀锥氯滔噍腿≈疵摬怀浞?，回收率低?/p>

金霉素只有GB/T 21317-2007 方法回收率能滿足實(shí)驗(yàn)要求，這與金霉素自身的特點(diǎn)有關(guān)，金霉素較易水解[9]，其分解速度與pH 和溫度有關(guān)系，堿性和中性條件下水解速度明顯大于酸性條件，高溫條件下的水解速度明顯大于室溫。農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號(hào)文件采取超聲提取的方法，超聲過(guò)程中會(huì)放熱，加速了金霉素的水解，且氮吹溫度45℃，同樣加速了金霉素的水解，以致金霉素的回收率30%，三個(gè)方法中回收率最低；農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告-12-2008 方法提取至有渦動(dòng)混勻，沒(méi)有經(jīng)過(guò)超聲提取，提取不充分，因此金霉素的回收率只有43%；GB/T 21317-2007 方法中采取的是冰水浴超聲提取，且離心溫度設(shè)置-2℃，均能降低金霉素的水解，所以此方法金霉素的回收率能達(dá)到75%，能夠滿足回收率的要求。

3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化及注意事項(xiàng) （ 以GB/T 21317-2007 為例子）

3.1 樣品解凍

一般樣品中在-18℃以下冰箱里冰凍存放，檢測(cè)樣品恢復(fù)至室溫后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法處理，嚴(yán)禁用微波等加熱方式對(duì)樣品進(jìn)行解凍，應(yīng)在室溫下自然解凍后再進(jìn)行前處理。

3.2 離心機(jī)最優(yōu)溫度-2℃

由于離心機(jī)高速轉(zhuǎn)動(dòng)起來(lái)會(huì)放熱，且部分離心機(jī)達(dá)不到設(shè)置的溫度，所以一般溫度設(shè)置在-2℃左右，溫度太高油脂是液體狀態(tài)，進(jìn)入提取液，凈化時(shí)時(shí)會(huì)堵塞固相萃取柱，降低回收率；溫度太低，試樣結(jié)冰，部分殘?jiān)鼤?huì)包裹在冰中，凈化時(shí)時(shí)會(huì)堵塞固相萃取柱，降低回收率。

3.3 洗脫液的用量

由于固相萃取柱的廠家不同，填充的密度不同，導(dǎo)致固相萃取柱有差異，且部分四環(huán)素吸附在柱子上，洗脫液的量過(guò)少會(huì)致使部分四環(huán)素洗脫不完全，洗脫液量過(guò)多會(huì)洗脫出雜質(zhì)，對(duì)上機(jī)有干擾造成正偏差，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)的洗脫液量15mL。以加標(biāo)100ug/kg 為例，不同的洗脫液回收率如下：

洗脫液用量（mL）回收率（%）四環(huán)素 土霉素 金霉素5 51 55 25 10 68 75 40 15 80 86 75

4 結(jié)論

本文通過(guò)動(dòng)物源食品中四環(huán)素的檢測(cè)，農(nóng)醫(yī)發(fā)【2017】1 號(hào)文件附錄8，GB/T 21237-2007，農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告-12-2008 三種方法的對(duì)比，以雞肉為例，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，且對(duì)部分實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)GB/T 21237-2007 的不僅實(shí)驗(yàn)操作方便且方法回收率較高，準(zhǔn)確性高，能較好的滿足實(shí)驗(yàn)要求。