劉 靜，郭日新，戴 忠，馬雙成

（中國食品藥品檢定研究院 北京 100050）

2017年10月，Science Translation Medicine刊出“臺灣及亞洲地區(qū)肝癌發(fā)病與馬兜鈴酸及其衍生物高度相關(guān)”的文章[1]，再次引發(fā)社會各界對含馬兜鈴酸中藥安全性的廣泛關(guān)注與熱議。自上世紀(jì)90 年代馬兜鈴酸腎毒性報道以來，許多國家和地區(qū)相繼禁止使用含有或疑似含有馬兜鈴酸成分的藥材與制劑。我國在2003-2004 年也采取了一些風(fēng)險控制措施，包括禁止使用馬兜鈴酸含量高的關(guān)木通、廣防己和青木香等藥材，同時明確對含馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤和朱砂蓮的制劑嚴(yán)格按處方藥管理等[2-11]。但是，一些馬兜鈴酸成分含量低的中藥材飲片與中成藥仍在使用中，鑒于馬兜鈴酸類成分明確的腎毒性、致癌致突變等危害[2-11]，有必要進一步加強相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)險評估。因此，本文在總結(jié)馬兜鈴酸類成分信息的基礎(chǔ)上，對其檢測方法、標(biāo)準(zhǔn)收載及限度規(guī)定等研究現(xiàn)狀進行了調(diào)研分析，為其準(zhǔn)確檢測提供了技術(shù)借鑒與參考，同時也為有關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)險控制與安全使用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 成分信息

從結(jié)構(gòu)上看，馬兜鈴酸類似物是具有硝基菲母核的一類化合物，包括馬兜鈴酸（aristolochic acids，AAs）和馬兜鈴內(nèi)酰胺（aristolactams，ALs）兩種結(jié)構(gòu)類型（圖1），其中馬兜鈴內(nèi)酰胺除在某些植物中存在外，也被認為是馬兜鈴酸經(jīng)硝基還原酶還原產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[12-15]。報道顯示，馬兜鈴酸類似物主要存在于馬兜鈴屬及細辛屬等馬兜鈴科植物中，主要包括20 多個化合物，由表1可見其結(jié)構(gòu)非常類似，有的還是同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)差異在于羥基和/或甲氧基取代位置的不同（表1）。

馬兜鈴酸類化合物雖然報道較多，但文獻調(diào)研顯示研究整體集中于馬兜鈴酸I，分析主要因其含量相對比較高且毒性明確，此外還涉及馬兜鈴酸II、III、IVa、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 等成分[16-42,46-53]。例如，陳婧等研究顯示遼細辛根和根莖中馬兜鈴酸IVa的含量高于馬兜鈴酸I[20]。田禾苗等研究認為由于馬兜鈴酸類成分是馬兜鈴藥材中的主要有毒成分，因此以馬兜鈴酸III、7-羥基馬兜鈴酸I、馬兜鈴內(nèi)酰胺I、馬兜鈴酸I 為指標(biāo)成分能更全面地評價和控制馬兜鈴的毒性[27]。

表1 部分馬兜鈴酸類似物基本信息

2 研究現(xiàn)狀

2.1 毒性作用

1993 年，比利時學(xué)者在《柳葉刀》（Lancet）雜志報道的馬兜鈴酸腎病事件，引起人們對于馬兜鈴酸類成分毒性作用的廣泛關(guān)注與重視[2-3]。隨后十年間，大量文獻報道了馬兜鈴酸類成分的腎毒性、致癌致突變作用，相關(guān)成分主要涉及馬兜鈴酸I 和II[4-10]。近十余年來，馬兜鈴酸毒性作用相關(guān)的文獻報道主要集中于作用機制方面的研究[54,55]。

馬兜鈴酸腎毒性作用的研究報道較多，目前尚無關(guān)于損傷機制的統(tǒng)一觀點，但有幾個主要研究方向，一是腎小管上皮細胞壞死或凋亡機制，研究表明大劑量馬兜鈴酸可直接損傷腎小管上皮細胞導(dǎo)致細胞壞死或凋亡，其主要分子機制涉及微小RNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激。二是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化機制，研究顯示長期小劑量馬兜鈴酸導(dǎo)致腎臟損害的重要特征是腎間質(zhì)纖維化，而腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化則是腎間質(zhì)纖維化的主要機制。三是DNA損傷方面，研究表明馬兜鈴酸與DNA 形成的加合物在腎臟蓄積也可能是馬兜鈴酸腎毒性機制之一；此外還有細胞毒假說、代謝酶與腎損傷等方面的報道[4-10,54,55]。

圖1 馬兜鈴酸（I）和馬兜鈴內(nèi)酰胺（II）結(jié)構(gòu)骨架

馬兜鈴酸類似物的致癌致突變作用研究顯示其主要分子機制是馬兜鈴酸-DNA 加合物的形成，其中脫氧腺苷-馬兜鈴酸加合物可導(dǎo)致腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）的轉(zhuǎn)換突變，即AT→TA。有研究人員采用Ames波動試驗對AAI、AA II、AA III 和AA IV 4 種成分的致突變作用進行了對比研究，結(jié)果表明AA I、AA II在-S9和+S9條件下均顯示出較強的致突變作用，AA II 致突變作用強于AA I；AA III和AA IV對2株菌株均未顯示出明顯的致突變作用[56]。

2.2 檢測方法

文獻調(diào)研顯示馬兜鈴酸類成分的檢測分析方面的報道較多，其中檢測技術(shù)涵蓋薄層色譜法、液相色譜法、液質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法和毛細管電泳法等多種分析技術(shù)與方法[16-53]，以色譜法最為常用。隨著現(xiàn)代分析儀器與技術(shù)的快速發(fā)展，其中薄層掃描法目前已很少應(yīng)用，尤以液相色譜及聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用最為普遍。

馬兜鈴酸類成分的結(jié)構(gòu)決定其具有典型的紫外吸收特征，因此，液相色譜法又以HPLC-UV 最為經(jīng)典常用，也是《中華人民共和國藥典》（2015 版）一部(簡稱“2015 版藥典一部”)收載的方法?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)文獻報道的主要差別在于檢測波長不同（UV 250、252、254、260 nm）、流動相不同（甲醇或乙腈-含酸或緩沖鹽系統(tǒng)）以及色譜柱類型及型號不同[19-30]。例如凌鴻等采用Diamonsil C18柱，以乙腈-0.05% 磷酸為流動相，通過HPLC-UV 法（檢測波長260 nm）考察不同采收期木通馬兜鈴不同部位中馬兜鈴酸I 含量，結(jié)果顯示馬兜鈴酸I在根及葉中含量較高，在莖、果實中馬兜鈴酸Ⅰ的含量最低且比較穩(wěn)定，含量基本不隨生長時間改變[24]。周雪紅等采用固相萃取小柱樣品前處理方式，以Phenomenex Luna C18柱，乙腈:0.2% 碳酸銨溶液（稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.5）為流動相，檢測波長250 nm，建立了麻黃止嗽丸中馬兜鈴酸A 的HPLC-UV 限量測定方法[25]。黃可婧等通過樣品提取、固相萃取前處理方式，以Phenomenex C18柱，乙腈-1% 冰醋酸（38:62）流動相，檢測波長250 nm，建立了六經(jīng)頭痛片中馬兜鈴酸I 的HPLC-UV 限量檢查方法[29]?？偨Y(jié)表明，HPLC-UV 法適用于馬兜鈴酸類成分含量相對高、不存在干擾或通過適當(dāng)前處理方式可排除干擾的中藥材飲片及中成藥品種。

對于一些馬兜鈴酸類成分含量低或者存在干擾的中藥品種而言，采用HPLC 法難以實現(xiàn)其準(zhǔn)確定性與定量；而液質(zhì)聯(lián)用法具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性強，不易受干擾等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于中藥材飲片、中成藥、保健品等不同樣品中馬兜鈴酸成分以及不同基質(zhì)中馬兜鈴酸（Aristolochic Acid，AA）-DNA 加合物的檢測與分析[32-45]。馬兜鈴酸成分檢測方面，劉螢等采用超高效液相色譜-電噴霧三重四級桿質(zhì)譜法，以正離子、多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）測定了柴胡、生甘草、龍膽瀉肝丸、減肥茶等14種樣品中馬兜鈴酸A和B的含量，其中馬兜鈴酸A 以m/z359.1-298.0 為定量離子對，m/z359.1-296.0為定性離子對，馬兜鈴酸B以m/z329.1-294.0為定量離子對，m/z329.1-268.0為定性離子對[35]。Liu Yiming 等采用HPLC-MS/MS 法，以正離子、MRM 對大鼠血漿中馬兜鈴酸I 進行了藥代動力學(xué)研究，分別以m/z359.0-298.2、m/z373.1-305.2 作為馬兜鈴酸I及內(nèi)標(biāo)非那司提的定量離子對[42]?？傮w而言，液質(zhì)聯(lián)用法檢測模式以正離子、MRM 為主；為提高離子化效率，流動相中通常加入一定濃度的銨鹽添加劑。離子對的選擇方面，母離子主要為[M+NH4]+（如馬兜鈴酸I，m/z359），子離子主要有[M+H-NO2]+、[M+HCO2]+、[M+H-H2O]+（如馬兜鈴酸I，子離子主要為m/z296，298，324）[31-42]；實際檢測過程中尚需優(yōu)化確定碎裂電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)。

AA-DNA 加合物檢測方面，由于研究認為此加合物可在腎臟不斷蓄積，干擾、阻斷轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制，導(dǎo)致細胞凋亡甚至癌變，因此目前已用作研究馬兜鈴酸誘變和致癌的生物標(biāo)志物[43,45]。相關(guān)研究主要集中于AA I和AA II，二者經(jīng)代謝形成馬兜鈴酸內(nèi)酰胺氮離子（AL），AL與DNA堿基（A、G、C）環(huán)外氨基結(jié)合，形成相應(yīng)的AA-DNA 加合物（圖2）[43,44]。同時，目前多種AADNA 加合物經(jīng)已可通過LC-MS/MS 體外表征，作為體內(nèi)相應(yīng)加合物的定量分析對照，例如Chan Wang 等在制備純化dA-DNA 加合物的基礎(chǔ)上，采用LC-ESI-MS技術(shù)實現(xiàn)了給藥馬兜鈴酸后大鼠腎臟和肝臟組織中相應(yīng)加合物的檢測與分析，結(jié)果給藥5、30 mg·kg-1大鼠腎臟中可檢測到dA–AAII、dA–AAI、dC–AAII，同時，以自制dA-AA II 加合物為對照，在假設(shè)dA–AAI和dC–AAII 與dA–AAII 的ESI-MS 響應(yīng)相同的基礎(chǔ)上，測定了給藥后大鼠體內(nèi)dA–AAII、dA-AAI 和dCAAII的濃度[43]。Guo Lin等采用UPLC-MS/MS 技術(shù)、多反應(yīng)監(jiān)測模式，以利血平為內(nèi)標(biāo)，實現(xiàn)了給藥馬兜鈴酸后大鼠脫落的尿路上皮細胞中dA-AAI 的定量分析，AA I以10 mg/kg/d的劑量連續(xù)口服給藥1個月后，大鼠尿路上皮細胞每109 個正常dA 中可檢測到2.1 ± 0.3 dA-AAI，方法檢出限為1 ng·mL-1；與傳統(tǒng)32P-標(biāo)記和HPLC熒光檢測法相比，該方法更專屬、準(zhǔn)確、快速[44]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)收載情況

圖2 馬兜鈴酸I、II的代謝活化及其DNA加合物的形成[43-44]

通過梳理在用含馬兜鈴酸類成分的中藥材及中成藥品種，就中藥材而言，我國有法定標(biāo)準(zhǔn)的中藥材品種有24種，包括大葉青木香、朱砂蓮、天仙藤、馬兜鈴、防己、漢防己、木防己、木香馬兜鈴、大青木香和尋骨風(fēng)以及苕葉細辛、烏金七、湘細辛、細辛、甘肅細辛、毛細辛和金耳環(huán)等；其中馬兜鈴屬14 種、細辛屬10 種；而2015版藥典一部收載的品種僅包括馬兜鈴、天仙藤和細辛3 種藥材[57-59]，其余均為地方藥材標(biāo)準(zhǔn)所收載；就中成藥而言，由于目前沒有完整、權(quán)威的信息庫，所以只能通過多途徑交叉檢索的方式，據(jù)不完全統(tǒng)計，處方含馬兜鈴科藥材的中成藥有300 余種，處方僅涉及細辛一種藥材的品種有200 多種；其中2015 版藥典一部收載處方中含細辛的中成藥品種共53種。

2.4 限度規(guī)定情況

隨著對馬兜鈴酸類成分毒性作用研究的不斷深入，我國在2003-2004 年相繼采取了系列風(fēng)險防控措施：①取消了關(guān)木通、廣防己和青木香的藥用標(biāo)準(zhǔn)；②對含馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤和朱砂蓮4個藥材的中成藥品種嚴(yán)格按照處方藥管理，并在藥品說明書中增加導(dǎo)致腎損害的安全警示信息；③將細辛藥用部位由全草修改為根和根莖。此外，限度規(guī)定方面，目前僅2015版藥典一部天仙藤和細辛項下規(guī)定馬兜鈴酸I的限度分別不得過0.01% （萬分之一）和0.001% （十萬分之一）[58,59]；而馬兜鈴項下則沒有關(guān)于馬兜鈴酸Ⅰ的限量，僅提示本品含有馬兜鈴酸，可能引起腎臟損害等不良反應(yīng)，兒童及老年人慎用；孕婦、嬰幼兒及背功能不全者禁用[54]。盡管目前馬兜鈴酸類成分檢測技術(shù)與方法發(fā)展較為成熟，但限度規(guī)定相關(guān)的研究報道相對較少[27,60,61]。田禾苗等采用文獻報道的美國馬里蘭貝賽斯達鼠（NMRI）雄性小鼠轉(zhuǎn)化后含有量上限作為馬兜鈴中馬兜鈴酸I的含有量上限，以人LD5劑量的1/10為安全劑量上限，按平均體重60 kg 計算，并以馬兜鈴最大服用量9 g計，計算出馬兜鈴藥材中馬兜鈴酸I的限量應(yīng)不超過0.02%[27]。研究同時測定了馬兜鈴酸III、7-羥基馬兜鈴酸I、馬兜鈴內(nèi)酰胺I 的含量，因無相關(guān)的LD50報道，作者認為用馬兜鈴酸I毒性代替此3種馬兜鈴酸成分具有一定合理性，故暫定以上述4 種馬兜鈴酸總和進行限量控制[27]。李功輝等以馬兜鈴酸為例探討了中藥毒性成分限量標(biāo)準(zhǔn)制定方法，認為可以借鑒環(huán)保等領(lǐng)域中有毒有害成分限量標(biāo)準(zhǔn)制定，首先應(yīng)根據(jù)中藥毒性成分的毒理學(xué)評價結(jié)果，確立毒性成分的無可見有害作用劑量(no observed adverse effect level，NOAEL)，最低有害作用劑量( lowest observed adverse effect level，LOAEL)或者基準(zhǔn)劑量( benchmark dose，BMD)，結(jié)合適宜的安全因子，推導(dǎo)并確定每日允許攝入量，然后根據(jù)限量標(biāo)準(zhǔn)理論值計算公式，最終確定中藥中毒性成分的限量標(biāo)準(zhǔn)[60]。

3 總結(jié)

總體而言，盡管馬兜鈴酸類似物較多，其毒性作用自首次報道以來即引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注與重視，并開展了大量的相關(guān)研究工作，但是，目前毒性作用研究明確的成分仍主要集中于馬兜鈴酸I 和II，其余成分的腎毒性及致癌性差異尚難以明確。另一方面，我國仍在使用的含馬兜鈴酸類成分的中藥材飲片及中成藥品種較多，盡管研究表明此類成分的檢測與分析方法較為成熟，但其中馬兜鈴酸成分的定性、定量以及限度規(guī)定等研究均較為欠缺，因此有必要在明確其中馬兜鈴酸成分及含量的同時，進一步開展系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，以充分評估其風(fēng)險，從而制定出可保障用藥安全的限度規(guī)定。然而，馬兜鈴酸成分限度標(biāo)準(zhǔn)的制定工作既備受關(guān)注又面臨重重難點，這是由于目前我們在中藥毒性成分研究方面缺乏明確的限量標(biāo)準(zhǔn)研究方法，而毒性成分限量標(biāo)準(zhǔn)制定方法是建立毒性成分限量標(biāo)準(zhǔn)的前提。此外，中藥所含成分會受加工炮制、配伍等因素影響，中藥毒性成分的限量還涉及毒性成分本身、服用量、服用時間以及毒理學(xué)研究基礎(chǔ)等諸多因素。因此，接下來有必要首先對含馬兜鈴酸成分的相關(guān)中藥品種進行梳理、調(diào)研，通過系統(tǒng)而深入的藥學(xué)及毒理學(xué)基礎(chǔ)研究實現(xiàn)其安全性再評價，進而開展相應(yīng)的風(fēng)險控制措施，以更好地保障臨床用藥的安全性。