劉 靜，劉 匯，姚令文，戴 忠＊＊，馬雙成＊＊

（1.中國食品藥品檢定研究院 北京 100050；2.延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗所 延吉 133002）

研究發(fā)現(xiàn)部分馬兜鈴酸類化合物具有腎毒性、致癌致突變作用，對人體危害大，其安全性問題首次引起廣泛關注與重視是在1993年，比利時學者在《柳葉刀》（Lancet）雜志報道了布魯塞爾地區(qū)有女性在服用含中草藥減肥藥后導致嚴重腎病事件[1]。隨后，多個國家和地區(qū)報道了類似病例，且后續(xù)追查確證了馬兜鈴酸類成分為致病成分，并相繼禁止使用含馬兜鈴酸類成分的藥用植物和制劑[2-8]。我國自2003 年以來采取了一系列風險防控措施，其中包括取消關木通、廣防己和青木香的藥用標準，并分別用木通、防己和土木香替代使用。

2017 年10 月，科學雜志的子刊轉(zhuǎn)化醫(yī)學雜志（Science translational medicine）刊出“臺灣及亞洲地區(qū)肝癌發(fā)病與馬兜鈴酸及其衍生物高度相關”的研究論文[8]，再次引發(fā)公眾對于含馬兜鈴酸成分中藥安全性的熱議及媒體的廣泛關注[9]。為進一步查清目前市場上相關產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，為掌握是否仍然存在以禁用品種替代使用或者混用的問題，本研究選取曾因處方中關木通導致馬兜鈴酸腎病事件的龍膽瀉肝丸為篩查品種，作為一種常用中藥復方制劑，本品具有清肝膽，利濕熱的功效，用于肝膽濕熱，頭暈目赤，耳鳴耳聾，耳腫疼痛，脅痛口苦，尿赤澀痛，濕熱帶下；其用藥歷史悠久，歷版中國藥典均有收載，現(xiàn)行標準收載于《中華人民共和國藥典》（2015 年版）一部，其處方由龍膽、柴胡、黃芩、梔子（炒）、澤瀉、木通、鹽車前子、酒當歸、地黃和炙甘草十味藥組成[10]。本研究旨在建立本品中馬兜鈴酸I成分的檢測方法，以更好地保障用藥安全性。

目前，馬兜鈴酸類成分檢測分析方面的文獻報道較多，檢測技術(shù)涵蓋薄層色譜法、液相色譜法、液質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法等多種分析技術(shù)與方法，尤以液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應用最為普遍。其中，液相色譜法是《中華人民共和國藥典》（2015 年版）一部細辛和天仙藤項下收載的馬兜鈴酸I 限量檢查方法[11,12]，調(diào)研分析顯示HPLC-UV 法適用于馬兜鈴酸類成分含量相對高、不存在干擾或通過適當前處理方式可排除干擾的中藥品種[13,14]。液質(zhì)聯(lián)用法具有定性準確、靈敏度高、專屬性強、不易受干擾等優(yōu)勢，目前已廣泛應用于中藥材飲片、中成藥、保健品等不同樣品中馬兜鈴酸成分以及不同基質(zhì)中馬兜鈴酸-DNA加合物的檢測與分析[15-25]。結(jié)合文獻調(diào)研結(jié)果以及本品處方特點，本文首次研究建立了龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸I的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法并對所有樣品進行了篩查，為后續(xù)工作提供了基礎數(shù)據(jù)與科學依據(jù)，更好地保障了人民用藥安全。

1 儀器與試藥

Agilent1260-6410B 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，安捷倫Mass Hunter 化學工作站；METTLER XS105 型、AE240 型電子分析天平；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司；超聲功率：300 W；頻率：40 kHz）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)。

馬兜鈴酸I 對照品（批號110746-201611，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，F(xiàn)ischer 公司），甲醇（分析純，國藥化學試劑有限公司），甲酸為質(zhì)譜純（賽默飛世爾公司），乙酸銨（HPLC 色譜純，賽默飛世爾公司），水為超純水。

龍膽瀉肝丸共51批，來源于9家生產(chǎn)企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18 (2.1 × 50 mm，1.8 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，0.1% 甲酸（含5 mmol·L 乙酸銨）溶液為流動相B，按下表中梯度程序洗脫（表1）；流速0.3 mL·min-1；進樣量：1 mL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electronic spray ionization，ESI），正離子掃描，多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring）；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速9 L?min-1；霧化氣壓力30 psi；源電壓4000 V；馬兜鈴酸I保留時間為12.79 min，母離子m/z359.0，子離子m/z298.0（定量），m/z296.0（定性），裂解電壓為70 eV，碰撞能量為5 V。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取馬兜鈴酸I 對照品適量，加甲醇制成2 μg·mL-1的對照品儲備溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.4 供試品溶液制備

取本品水丸（6 g/袋）5袋，粉碎，取2 g；大蜜丸（6 g/丸）2丸，剪碎，加6 g硅藻土，研勻，取6 g；精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：300 W；頻率：40 kHz）30 分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察

取對照品儲備溶液，分別用甲醇逐級稀釋，得到系列對照品溶液，分別進樣1 ?L，記錄峰面積。以質(zhì)量為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y繪制馬兜鈴酸I的標準曲線并進行線性回歸，結(jié)果馬兜鈴酸I 在20.0767~240.9204 pg 范圍內(nèi)線性關系良好，其回歸方程為Y=17.333X-49.833（R2=0.9992）。

2.5.2 檢出限和定量限

（1）儀器檢出限和定量限

將對照品溶液稀釋至不同濃度，進樣測定，以信噪比3:1為檢出限、10:1為定量限，測定結(jié)果分別為2.008 pg、6.024 pg。

（2）方法檢出限（基質(zhì)效應考察）

取陰性樣品2 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入一定濃度馬兜鈴酸I對照品1 mL（50 ng·mL-1），精密加入甲醇24 mL，稱重，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷，用甲醇補足失重，取續(xù)濾液，過0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。進樣測定，以信噪比3∶1 為檢出限，測定表明本品方法檢出限為2.008 pg。

2.5.3 精密度試驗

取同一龍膽瀉肝丸溶液（No.10），按2.1、2.2 項下色譜與質(zhì)譜條件重復進樣6次，記錄譜圖。馬兜鈴酸I峰面積的RSD分別為1.6% ，表明精密度良好。

2.5.4 重復性試驗

圖1 HPLC-MS/MS篩查馬兜鈴酸I

分別取同一批龍膽瀉肝丸（No.10）6份，精密稱定，按2.4 法制備供試品溶液，按2.1、2.2 項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果測得馬兜鈴酸I 的含量分別為2.03、2.05、2.11、2.20、2.14、2.26 mg·g-1，RSD 為3.61% ，表明方法重復性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

取2.5.5 同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24h 測 定峰 面 積，馬兜 鈴酸I 峰 面 積 的RSD 為4.64% ，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 回收率試驗

精密稱取已測知馬兜鈴酸I含量的龍膽瀉肝丸樣品（水丸）1.0 g，置50 ml 具塞錐形瓶中，精密加入馬兜鈴酸I含量為2 mg·mL-1對照品溶液1 mL，精密加入甲醇24 mL，稱定重量，超聲處理30 分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，結(jié)果馬兜鈴酸I 的平均回收率為111.53% ，RSD為3.73% （表2）。

2.6 樣品測定

51 批樣品按2.4 項下制備供試品溶液，按2.1、2.2項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定，結(jié)果僅9、10號樣品檢出馬兜鈴酸I，檢測結(jié)果分別為0.66 μg·g-1、2.13 μg·g-1；其余樣品未檢出，詳見表3。

表2 加樣回收試驗計算結(jié)果

表3 樣品檢測結(jié)果

3 討論

3.1 馬兜鈴酸I檢測方法的選擇

研究過程中首先嘗試采用適用范圍廣的高效液相色譜法對龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸I 進行檢測，但由于本品處方所含藥味多、成分復雜，存在其他成分干擾馬兜鈴酸I的情況，難以實現(xiàn)其準確檢測與分析，因而進一步選擇采用不易受干擾的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對本品所含馬兜鈴酸I進行檢測。

3.2 多反應監(jiān)測模式離子對的選擇

通過調(diào)研液質(zhì)聯(lián)用法檢測馬兜鈴酸I 的相關文獻[15-25]，結(jié)果顯示主要采用正離子、多反應監(jiān)測模式，母離子以m/z359為主，子離子有m/z298、296、324、268等。在實驗過程中，經(jīng)全掃描模式、子離子掃描模式優(yōu)化質(zhì)譜條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)碎片離子m/z298.0 豐度最強，其次為碎片離子m/z 296.0，因此選擇m/z359.0-298.0離子對用于定量，m/z359.0-296.0離子對用于定性。

3.3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，本次抽樣9 家企業(yè)51 批次龍膽瀉肝丸樣品中，有2 批樣品中檢出馬兜鈴酸I，涉及1 家企業(yè)。由于本品處方中含有木通，不應檢出馬兜鈴酸I，表明可能存在木通混入關木通的現(xiàn)象。鑒于馬兜鈴酸I對人體的危害性，針對本研究結(jié)果，已申請龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸I 檢查項補充檢驗方法，從而為后續(xù)工作提供基礎數(shù)據(jù)與科學依據(jù)，以更好地保障人民用藥安全。