李銳 劉冠澤 盧迎春 楊建文 關(guān)德軍 楊生超

摘 ?要??收集和鑒定了云南省和貴州省共46份燈盞花種質(zhì)資源，篩選出適合生產(chǎn)不同藥品的成分專(zhuān)用型種源，為專(zhuān)用型品種選育提供參考。利用HPLC測(cè)定了燈盞花種源10種活性成分含量，相關(guān)分析闡明各成分含量間的相關(guān)性，聚類(lèi)分析對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)。結(jié)果表明：16份燈盞花種源燈盞乙素（scutellarin， SE）含量在2.5%以上，是培育燈盞花素專(zhuān)用型品種的優(yōu)良材料，其中4份種源同時(shí)含有高含量（>1.0%）的雙咖啡?？鼘幩狨ィ╠icaffeoylquinic acids， diCQAs），是培育燈盞細(xì)辛專(zhuān)用型品種的優(yōu)良材料;同時(shí)，篩選出8份總黃酮（total flavonoids， TFs）含量高于3.5%的種源，適合選育總黃酮專(zhuān)用品種。相關(guān)性分析表明，SE含量與diCQAs和TFs含量均顯著正相關(guān)，是燈盞花品質(zhì)育種的標(biāo)志性成分。聚類(lèi)分析將燈盞花種源分為三大類(lèi)，除1個(gè)種源的SE含量和diCQAs含量接近（第Ⅲ類(lèi)）外，其他種源SE均占總活性成分的60%以上，其中第Ⅰ類(lèi)為高TFs型種源，TFs占到總活性成分的80%以上，diCQAs占總成分的15%以下;第Ⅱ類(lèi)為高diCQAs型種源，diCQAs占總成分的16.9%～28.9%，TFs占到總活性成分的80%以下。該結(jié)果表明燈盞花種源活性成分組成存在多種類(lèi)型，為專(zhuān)用型品種選育提供了可能，燈盞乙素含量可以作為專(zhuān)用型種源篩選的首要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 ?燈盞花;專(zhuān)用型種質(zhì)資源;燈盞乙素;相關(guān)性分析中圖分類(lèi)號(hào)??S31??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Evaluation and Identification of Special Composition Germplasms in Erigeron breviscapus

LI Rui^1，2， LIU Guanze^1，2， LU Yingchun^1，2， YANG Jianwen³， GUAN Dejun²，?YANG Shengchao^1，2*

1. National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwestern China， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Key Laboratory of Medicinal Plant Biology of Yunnan Province， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan?650201， China; 3. Yunnan Hongling Biotechnology Co.， Ltd.， Luxi， Yunnan 652499， China

Abstract ?Forty sixErigeron breviscapusgermplasms?were collected from Yunnan and Guizhou provinces， and the active constituents were determined for selecting special composition germplasms. Ten active constituents in the germplasms were determined by HPLC （high performance liquid chromatography）， the relationships among the contents of different active constituents were revealed by correlation analysis， and the germplasms were classified into different groups by cluster analysis according to the composition of active constituents. Sixteen germplasms with a content of scutellarin （SE）?more than 2.5% were the ideal materials for breeding breviscapine-type cultivars， among them， four germplasms with a content of dicaffeoylquinic acids （diCQAs）?more than 1% were suitable for breeding Dengzhanxixin-type cultivars. Furthermore， eight germplasms with total flavonoids （TFs） more than 3.5% were suitable for breeding flavone-type cultivars. The content of SE was positively correlated with the contents of diCQAs and TFs， indicating that SE was the selective marker for quality breeding inE. breviscapus. Most germplasms were included in two clades （I?and II） by cluster analysis， except one germplasm， which containing equal contents of SE and diCQAs （III）. The first clade （I）， designed as high TFs-type germplasms， contained higher TFs relative content （more than 80%） and lower diCQAs relative content （less than 15%）， while the second clade （II） were characterized by high relative contents of diCQAs （16.9%-28.9%） and lower TFs relative content （less than 80%）.

Keywords ?Erigeron breviscapus;?special composition germplasms; scutellarin; correlation analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.007

燈盞花[Erigeron breviscapus （Vant.） Hand-Mazz.]為菊科飛蓬屬植物，主要分布于我國(guó)云南、四川、貴州、廣西、西藏、湖南等西部和西南部海拔1200～3500 m的中山和高山開(kāi)闊山坡草地、林緣或疏林下，具有散寒解表、祛風(fēng)除濕、舒筋活血、消積止痛等功效^[1]。燈盞花是云南的道地藥材之一，采集量約占全國(guó)的95%^[2]。燈盞花主要活性成分燈盞花素（breviscapine）屬于黃酮糖苷類(lèi)化合物，主要是燈盞乙素（scutellarin， SE）和少量的燈盞甲素（apigenin-7-O-glucronide， APG），是治療閉塞性腦血管疾病和腦溢血后遺癥的天然特效藥物^[3]，能夠降低外傷性腦損傷、腦缺血/再灌注損傷和缺氧缺血性腦損傷等造成的神經(jīng)元損傷^[4-7]，對(duì)糖尿病腎病具有療效^[8]。燈盞花的另一類(lèi)活性成分為二咖啡酰奎寧酸酯（dicaffeoylquinic acids， diCQAs），主要包括1，3-O-二咖啡?？鼘幩幔?，3-diCQA），3，5-diCQA，4，5-diCQA和飛蓬酯乙（erigoster B， EB）等，具有與燈盞乙素相似的生物活性^[9-12]。

目前，以燈盞花為原料的中成藥全國(guó)共有18種，適應(yīng)癥主要集中在心腦血管領(lǐng)域。以燈盞花活性成分為主的藥品包括三大類(lèi)，第一類(lèi)藥品僅含燈盞花素，或其主要成分SE，如注射用燈盞花素、燈盞花素注射液和燈盞花素片等。第二類(lèi)藥品同時(shí)含有燈盞花素（主要是SE）和多個(gè)diCQAs單體，如燈盞細(xì)辛注射液、燈盞生脈膠囊、燈盞細(xì)辛膠囊等;第三類(lèi)藥品以總黃酮（total flavones， TFs）為主要成分，如益脈康膠囊等。因此，需要根據(jù)不同的藥品需要，分別選育燈盞花素專(zhuān)用型、燈盞細(xì)辛專(zhuān)用型和總黃酮專(zhuān)用型新品種。

隨著野生資源的日益枯竭^[13]，人工栽培已經(jīng)成為燈盞花藥材的主要來(lái)源。目前，云南省集中了我國(guó)98%的燈盞花種植和80%的活性成分提取，人工選育成分專(zhuān)用型品種勢(shì)在必行。課題組在種質(zhì)資源收集的基礎(chǔ)上，曾成功選育了兩個(gè)燈盞花新品種“千山1號(hào)”和“千山2號(hào)”^[14-15]，這2個(gè)品種都具有高產(chǎn)、高燈盞乙素（超過(guò)2.5%）的特點(diǎn)，已經(jīng)成為云南省燈盞花的主栽品種，累計(jì)種植面積超過(guò)2.67×10⁸m²，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。但是，目前生產(chǎn)上尚無(wú)燈盞細(xì)辛專(zhuān)用型和總黃酮專(zhuān)用型燈盞花品種。同時(shí)，燈盞花種子細(xì)小、世代周期短，品種極易退化，而且其嚴(yán)格的自交不親和性也容易引起品種的混雜退化，因此，需要不斷篩選優(yōu)良野生種源，培育成分專(zhuān)用型新品種以滿(mǎn)足藥材生產(chǎn)的需求。本研究收集和鑒定了云南省和貴州省共46份燈盞花種質(zhì)資源，以篩選出適合生產(chǎn)不同藥品的成分專(zhuān)用型種源，為專(zhuān)用型品種選育提供參考。

1??材料與方法

1.1 材料

1.1.1燈盞花種質(zhì)資源收集 ?46份燈盞花種質(zhì)分別收集于云南省12個(gè)地州市，以及貴州六盤(pán)水市等地區(qū)（表1），其中云南省44份，主要來(lái)自于紅河州（8份）、大理州（7份）、昆明市（6份）、曲靖市（5份）、麗江市（4份）、玉溪市（3份）、文山州、保山市、宣威市和昭通市各2份，怒江州和楚雄州各1份，與云南省毗鄰的貴州省六盤(pán)水市2份。采集的野生燈盞花植株栽植于云南紅靈生物科技有限公司，建立種質(zhì)資源圃。

1.1.2 ?試劑 ?燈盞花10種活性成分包括咖啡酸（caffeic acid， CA），綠原酸（chlorogenic acid， CGA），SE，1，5-diCQA，3，5-diCQA，4，5-diCQA，3，4-diCQA，EB，APG，野黃芩素（scutellarein， SA），均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，純度大于98%，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制及其含量測(cè)定用。乙腈（HPLC級(jí)，Cisher）為色譜純，甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)luka）為色譜純和分析純，磷酸（HPLC級(jí)，F(xiàn)luka）為分析純，水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 ?樣品采集和處理 ?種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)燈盞花種源初花期時(shí)，五點(diǎn)取樣法隨機(jī)選取30株，60?℃烘干作為一個(gè)樣品，每份種源重復(fù)3次。參考2015年版《中國(guó)藥典》第一部對(duì)燈盞花樣品溶液制備方法，將干燥后的植物材料研磨成粉用于活性成分含量測(cè)定。精密稱(chēng)量0.5 g研磨樣品，加入70%甲醇50 mL，超聲波提?。üβ?80 W，頻率40?kHz）30 min，0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于HPLC檢測(cè)。

1.2.2 ?HPLC檢測(cè)方法??試驗(yàn)采用Agilent ZOR BAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，2.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.2%磷酸+5%乙腈溶液（A）0.2%磷酸+40%乙腈+40%甲醇溶液（B），梯度洗脫0～0.2?min，5% B;0.2～20.0 min，20% B;20.0～20.5?min，100% B;20.5～25.0 min，100% B;25.0～25.5 min，5% B;檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm，進(jìn)樣體積10 μL，流速1.0?mL/min，柱溫為40?℃。以10個(gè)對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用于含量測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件計(jì)算各化合物性狀的標(biāo)準(zhǔn)差、平均值和變異系數(shù);應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、聚類(lèi)分析，其中聚類(lèi)分析采用Ward法。

2??結(jié)果與分析

2.1 燈盞花種源活性成分含量分布

本研究共檢測(cè)了燈盞花種源中的10種活性成分，包括3個(gè)黃酮類(lèi)物質(zhì)（SE、APG和SA），5個(gè)diCQA單體（1，5-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA、3，4-diCQA和EB）和2種有機(jī)酸（CA和CGA）。燈盞花種質(zhì)資源中SE的含量最高，其次是EB，APG和3，5-diCQA，其他成分的含量均較低（表2）。燈盞花主栽品種‘千山1號(hào)和‘千山2號(hào)是由紅河州個(gè)舊市（HHGJ）的野生種源選育而來(lái)，因此本研究中以其作為對(duì)照來(lái)篩選優(yōu)良種源。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，20份種源的SE含量顯著高于HHGJ，其中16份種源的SE含量高于2.50%，是培育燈盞花素專(zhuān)用型品種的優(yōu)良材料，其中4份種源同時(shí)含有高含量（>1.0%）的diCQAs，是培育燈盞細(xì)辛專(zhuān)用型品種的優(yōu)良材料。同時(shí)，篩選出8份TFs含量高于3.5%的種源，適合選育總黃酮專(zhuān)用品種（表3）。

2.2燈盞花活性成分含量的相關(guān)性分析

SE是燈盞花的最主要藥效成分，本研究發(fā)現(xiàn)SE含量與CA、EB、4，5-diCQA、SA、di-CQAs、TFs、Total呈顯著正相關(guān)，與3，5-diCQA、APG呈負(fù)相關(guān);di-CQAs與CA、SE、EB、4，5-diCQAs呈顯著正相關(guān);TFs與CA、SE、EB、4，5-diCQAs、SA、di-CQAs呈顯著正相關(guān)。育種中可以將SE作為3種專(zhuān)用型品種的標(biāo)記成分（表4）。

2.3 燈盞花種質(zhì)資源組分相對(duì)含量的聚類(lèi)分析

根據(jù)各成分的相對(duì)含量（占總活性成分含量的百分比）（表5），對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行了聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歐氏距離為20時(shí)，46份燈盞花種源分為三大類(lèi)，除1個(gè)種源的SE含量和diCQAs含量接近（第Ⅲ類(lèi)）外，其他種源SE均占總活性成分的60%以上，其中第Ⅰ類(lèi)為高TFs型種源，TFs占到總活性成分的80%以上，diCQAs占總成分的15%以下;第Ⅱ類(lèi)為高diCQAs型種源，diCQAs占總成分的16.9%～28.9%，TFs占到總活性成分的80%以下（圖1）。

其中第Ⅰ類(lèi)又可分為A、B兩個(gè)亞類(lèi)，其中A亞類(lèi)為高SE，低APG，其SE相對(duì)含量在70%左右，APG在15%以下;B亞類(lèi)SE相對(duì)含量在60%以上，APG在所有類(lèi)群中所占比重最高，達(dá)15%以上。第二類(lèi)包含C、D、E、F、G、H 5個(gè)亞類(lèi)，其中C亞類(lèi)SE占比在58%左右，4，5-diCQAs所占比重最高，達(dá)2.9%以上，diCQAs所占比重達(dá)24%以上。D亞類(lèi)SE占比在59%左右，EB在所有類(lèi)群中所占比重最高，為17.3%以上;diCQAs所占比重也最高，達(dá)26%以上。G亞類(lèi)的顯著特點(diǎn)是3，5-diCQA所占比重最高，高達(dá)9%以上。H亞類(lèi)APG在第二大類(lèi)群中APG比重是最高的，達(dá)12.9%以上。

3??討論

種質(zhì)資源是遺傳育種的基礎(chǔ)。本研究全面收集了包括云南省和貴州省共計(jì)46份燈盞花種質(zhì)，其中保山地區(qū)和怒江地區(qū)的燈盞花種質(zhì)資源是首次收集到，在燈盞花處于初花期時(shí)進(jìn)行樣品采集^[16]，并進(jìn)行了10種主要化合物的含量測(cè)定，高效檢測(cè)方法的建立為種源評(píng)價(jià)和成分間相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)。由于燈盞花是廣布種，本研究所采集到的燈盞花種源地理距離較大，而且不同分布區(qū)生態(tài)地理的差異、地理隔離以及具體生境的差別，長(zhǎng)期的自然選擇，致使不同分布區(qū)或生境的燈盞花在形態(tài)、生理、遺傳、生態(tài)習(xí)性等方面出現(xiàn)較大的分化，甚至形成了生態(tài)型^[17]。

在本次測(cè)定的46份燈盞花種質(zhì)資源中10種主要化合物均存在明顯差異，地理上相距較遠(yuǎn)的種質(zhì)間有效成分含量差異明顯，地理上相近的種質(zhì)資源間仍存在較大差異，這與先前研究結(jié)果相似^[15]。同時(shí)燈盞花具有嚴(yán)格的自交不親和性^[18]，這也就導(dǎo)致了不同種源之間成分含量差別較大。前人研究表明，燈盞花素與diCQA兩類(lèi)成分含量為正相關(guān)關(guān)系^[19]，通過(guò)各成分相關(guān)性分析顯示，SE含量與CA、EB、4，5-diCQA、SA、diCQAs、TFs顯著正相關(guān)。這與前人研究一致，但是上述研究?jī)H檢測(cè)了少數(shù)幾個(gè)組分，對(duì)更多單體組分間的相關(guān)性則缺乏了解，本研究較為全面對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析。在進(jìn)行聚類(lèi)分析后發(fā)現(xiàn)46個(gè)群體間根據(jù)化學(xué)成分表現(xiàn)出明顯的聚類(lèi)模式，但這種聚類(lèi)模式跟地理并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)規(guī)律，如高海拔地區(qū)成分之間仍然存在較大差異。Li等^[20]發(fā)現(xiàn)高緯度地區(qū)的氣候可顯著提高1，5-diCQA的產(chǎn)量，在本研究的測(cè)定結(jié)果中，1，5-diCQA含量均處于較低水平，并且和海拔無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)。因此，各成分與地理之間相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。

隨著燈盞花藥用價(jià)值的不斷開(kāi)發(fā)利用，其需求量也隨之不斷增長(zhǎng)，目前只有‘千山1號(hào)和‘千山2號(hào)2個(gè)燈盞花品種的燈盞乙素含量達(dá)到2.50%以上，并且在云南省有較大種植面積，但是這兩個(gè)品種其余活性成分的含量較低;在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，除了燈盞乙素之外還需要用到其他活性成分，這就需要多種活性成分含量更高的品種。同時(shí)燈盞花種源活性成分組成存在多種類(lèi)型，這也為專(zhuān)用型品種選育提供了可能，燈盞乙素作為燈盞花中最主要活性成分，可以作為專(zhuān)用型種源篩選的首要指標(biāo)。本研究在對(duì)野生燈盞花種質(zhì)資源收集并保存的基礎(chǔ)上進(jìn)行主要含量測(cè)定，初步篩選出針對(duì)特定藥用需求的優(yōu)質(zhì)燈盞花種源，為日后燈盞花野生種質(zhì)資源的選擇和培育指明方向。

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