李麗春，劉書(shū)貴，尹怡，鄭光明，馬麗莎，謝文平，戴曉欣，單奇，趙城

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州)，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

孔雀石綠(malachite green, MG)，又名堿性綠，是一種人工合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用于防治苗種、水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)發(fā)生的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲(chóng)病等[1-3]。其在生物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為隱色孔雀石綠(leucomalachite green，LMG)， MG和LMG均具有高毒、高殘留和“三致”(致癌、致畸和致突變)等副作用，二者在生物體內(nèi)消除時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)給水產(chǎn)品食用安全性帶來(lái)嚴(yán)重隱患[4-6]。歐盟等國(guó)已將MG列為禁用藥，原中國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》，禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用MG[7-9]。但由于MG對(duì)水霉病有特效，暫無(wú)其他有效替代藥，且其價(jià)格低廉，易獲取，目前仍存在違規(guī)使用MG的現(xiàn)象[10-11]。目前，水產(chǎn)品中MG的殘留測(cè)定方法主要有SDS增敏同步熒光測(cè)定[12]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]、熒光標(biāo)記磁分離免疫分析方法[16]和QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS法[17-18]等。水產(chǎn)品中MG殘留消除規(guī)律研究主要涉及的品種包括羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[19]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[20]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21-22]和大菱鲆(Psettamaxima)[23]等。關(guān)于鱖(Sinipercachuatsi)中MG殘留消除的研究亦有報(bào)道，如劉書(shū)貴等[24]和黃向榮等[25]研究了苗種期鱖體內(nèi)MG的富集消除規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MG及其代謝物L(fēng)MG在鱖幼魚(yú)體內(nèi)的殘留量分別于停藥后37 d和55 d時(shí)低于判定值1.0 μg/kg；尹怡等[26]用1.0 mg /L MG溶液浸泡2 min后的鯪(Cirrhinusmolitorella)投喂鱖10 d，研究陽(yáng)性餌料魚(yú)投喂下鱖體內(nèi)MG和LMG的殘留消除規(guī)律，結(jié)果表明，養(yǎng)殖過(guò)程中，陽(yáng)性餌料魚(yú)體內(nèi)的MG會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞給鱖，且鱖體內(nèi)LMG有檢出；萬(wàn)譯文等[27]采用5.0 mg/L MG浸泡體重為400 g左右的鱖2 h，研究鱖體內(nèi)MG和LMG的組織分布和消除規(guī)律，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖平均水溫為25.6 ℃時(shí)，MG及其代謝物L(fēng)MG在鱖各組織中消除至少需要680度日；李麗春等[28]模擬運(yùn)輸條件，研究了鱖體內(nèi)MG和LMG殘留消除規(guī)律，結(jié)果表明，在運(yùn)輸條件下鱖體內(nèi)MG 和LMG 消解較慢，易造成鱖中MG 和LMG 超標(biāo)?？梢?jiàn)，目前鱖中MG殘留消除規(guī)律的研究集中在苗種期、養(yǎng)殖過(guò)程和運(yùn)輸環(huán)節(jié)等，且大多在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。鱖體內(nèi)MG來(lái)源問(wèn)題至今難以解決，養(yǎng)殖環(huán)境中的MG和LMG殘留是否會(huì)造成鱖體內(nèi)MG和LMG殘留尚缺乏有效依據(jù)。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究通過(guò)模擬陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境，開(kāi)展鱖對(duì)MG和LMG富集消除規(guī)律研究，以期進(jìn)一步探究陽(yáng)性環(huán)境對(duì)鱖體內(nèi)MG殘留的影響，為鱖中MG殘留全鏈條評(píng)估和殘留關(guān)鍵控制節(jié)點(diǎn)的制定提供有效依據(jù)，同時(shí)為監(jiān)管部門的管控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

MG、LMG、氘代孔雀石綠(MG-D5)和氘代隱色孔雀石綠(LMG-D6)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer (德國(guó))。N-丙基乙二胺(PSA)和中性氧化鋁購(gòu)于CNW公司(美國(guó))。氯化鈉(分析純)、無(wú)水硫酸鎂(分析純)以及無(wú)水乙酸銨(分析純)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

主要包括：Waters UPLC-Xevo TQD MS/MS(Waters公司，美國(guó))；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；IKA MS3BS25漩渦振蕩器(德國(guó))；KQ-250E醫(yī)用超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；高速離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))；Organomation N-EVAP 112氮吹儀(美國(guó))；SIGMA 1-15小型臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó)))；0.22 μm微孔濾膜，玻璃管等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量的MG、LMG、MG-D5和LMG-D6標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別移取上述MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-18 ℃避光保存。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取上述MG-D5和LMG-D6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(1∶1，V/V)稀釋配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使該混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液含中MG-D5和LMG-D6的質(zhì)量濃度為5 ng/mL。

1.3.2 陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境的制備

模擬MG陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境，在面積約為1 400 m2、水深1.5 m的池塘中加入MG原藥，使水體中MG質(zhì)量濃度為0.2 mg/L，水體保持7 d，換水后測(cè)定其水體和沉積物中MG和LMG殘留量，以此為陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境。

1.3.3 模擬實(shí)驗(yàn)

于陽(yáng)性養(yǎng)殖池塘中放入健康鱖苗(每尾體重約10～20 g，由廣東省佛山市高明區(qū)鱖苗種生產(chǎn)農(nóng)戶提供)10 000尾，用陰性餌料魚(yú)喂養(yǎng)，分別于放入鱖后0.1、1.0、2.0、5.0、10、15、20、30、40、50、70、90、120、150、180和210 d等時(shí)間點(diǎn)采樣，檢測(cè)鱖體內(nèi)MG和LMG殘留量，直至鱖體內(nèi)無(wú)MG和LMG檢出。每個(gè)采樣點(diǎn)采集6個(gè)重復(fù)樣品，每個(gè)樣品不低于6尾，樣品采集后去頭、尾、內(nèi)臟和骨，高速勻漿混勻后，于-20 ℃保存待測(cè)。

1.3.4 樣品前處理

樣品在室溫下解凍后，準(zhǔn)確稱取(5.00±0.01) g于50 mL的聚丙烯離心管中，加入10 mL乙腈和100 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，漩渦振蕩2 min，加入2.0 g無(wú)水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，超聲波提取2 min，5 000 r/min離心5 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，剩余殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈，重復(fù)提取1次，合并上清液然后加入PSA 150 mg、中性氧化鋁300 mg和無(wú)水硫酸鎂300 mg，渦旋振蕩30 s，5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃離心管中，40 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，?2 mL乙腈-5mmol/L乙酸銨(1∶1，V/V)復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.5 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLCBEH C18(2.1×100.0 mm i.d., 1.7 μm)；流動(dòng)相A為乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L, pH=4.5), 流動(dòng)相B為乙腈，流速0.20 mL/min, 柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫Tab.1 Conditions of gradient elution

注：“φ”指體積分?jǐn)?shù)，A為乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L, pH=4.5), B為乙腈。

1.3.6 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；離子傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣流速650 L/h，錐孔流速50 L/h：掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MRM parameters

注：“*”代表定量離子。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

將1.3.1中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0.1～100.0 ng/mL的范圍內(nèi)配制成8個(gè)質(zhì)量梯度濃度(0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL)，每個(gè)濃度水平含5.0 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，采用上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物(MG和LMG)與內(nèi)標(biāo)物(MG-D5和LMG-D6)的峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.8 回收率和精密度

稱取5.00 g空白鱖肌肉樣品，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使肌肉組織中MG和LMG的含量為0.3、1.5和5.0 μg/kg，按照上述前處理方法和色譜質(zhì)譜條件檢測(cè)，每個(gè)含量水平設(shè)置6個(gè)平行樣品，測(cè)定其日內(nèi)和日間回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、檢出限和定量限

用空白樣品提取液配制成質(zhì)量濃度范圍在0.1～100.0 ng/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)標(biāo)含量為5.0 ng/mL)，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線并做線性回歸分析。結(jié)果表明：在上述色譜質(zhì)譜條件下可獲得較好的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1)，雜質(zhì)干擾較少且信號(hào)響應(yīng)較高；MG和LMG在0.1～100.0 ng/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r大于0.999 8(圖2)。

圖1 MG和LMG基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(10 ng·mL-1)Fig.1Chromatograms of MG and LMG standard solution (10 ng·mL-1)

圖2 MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2The standard curves of MG and LMG

在空白樣品中添加MG和LMG，分別以信噪比(S/N)等于3和10計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果表明，MG和LMG的LOD均為0.10 μg/kg，LOQ均為0.30 μg/kg(表3)。

2.2 回收率和精密度

用不含MG和LMG的鱖為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，按照上述前處理和儀器條件進(jìn)行測(cè)定。添加含量水平分別為0.3、1.5和5.0 μg/kg，每個(gè)添加水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其回收率和精密度。結(jié)果表明，鱖肌肉中MG和LMG回收率范圍為(96.40±5.34)%～(104.00±1.75)%和(92.40±2.54)%～(107.00±8.42)%，精密度范圍為1.68%～5.54%和2.75%～7.87%(表4)。該方法回收率和精密度較好，適用于鱖體內(nèi)MG和LMG殘留量的測(cè)定。

表3 MG和LMG的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.3 The calibration curves, correlation coefficient, LOD and LOQ of MG and LMG

表4 方法回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度Tab.4 Recovery, within-day precision and inter-day precision of the method n=6

2.3 陽(yáng)性環(huán)境中MG和LMG殘留量

質(zhì)量濃度為0.2 mg/L的MG池塘水體保持7 d后換水，采集水體和沉積物檢測(cè)其MG和LMG殘留量，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，使用過(guò)0.2 mg/L MG的養(yǎng)殖池塘7d后換水后的水體中未檢出MG和LMG，而沉積物中MG和LMG殘留量分別為：(233.48±17.07)μg/kg和(73.38±5.98)μg/kg。

表5 陽(yáng)性環(huán)境水體和沉積物中MG和LMG殘留量Tab.5 The residues of MG and LMG in water and sediments

注： “N.D.”表示未檢出(<0.1 μg·kg-1)?！啊北硎静淮嬖?。下同。

2.4 陽(yáng)性環(huán)境中鱖體內(nèi)MG和LMG殘留消除規(guī)律

模擬陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境，研究鱖在陽(yáng)性環(huán)境中對(duì)MG和LMG的富集消除規(guī)律。在MG陽(yáng)性環(huán)境中放入鱖苗后，于不同時(shí)間點(diǎn)采樣，測(cè)定其體內(nèi)MG和LMG殘留量，結(jié)果見(jiàn)表6和圖3。

表6 鱖體內(nèi)MG和LMG殘留量Tab.6 The residues of MG and LMG in mandarin fish n=6

圖3 鱖體內(nèi)MG和LMG富集消除規(guī)律Fig.3The enrichment and elimination of MG and LMG in mandarin fish

從表6和圖3可知，陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境中，鱖體內(nèi)MG殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LMG殘留量，其殘留量始終保持在1.0 μg/kg以下，0～10 d鱖體內(nèi)MG維持在0.62～0.80 μg/kg之間,隨后呈波動(dòng)式降低，70 d時(shí)達(dá)到定量限(0.30 μg/kg)以下，90 d時(shí)未檢出。而LMG在鱖體內(nèi)呈明顯的先富集后消除的規(guī)律，LMG殘留量在0.17～9.94 μg/kg之間，均在10 μg/kg以下。由上可見(jiàn)，陽(yáng)性環(huán)境鱖體內(nèi)MG殘留以LMG為主。鱖養(yǎng)殖10 d時(shí)體內(nèi)LMG達(dá)到最高水平9.94 μg/kg，隨后呈波動(dòng)式下降，在鱖體內(nèi)消除較慢，第240天達(dá)到方法定量限以下，240 d以后未檢出。鱖養(yǎng)殖周期一般為5～8個(gè)月，所以環(huán)境中殘留的MG會(huì)造成鱖體內(nèi)LMG的殘留。建議鱖養(yǎng)殖選擇沒(méi)有MG和LMG殘留的池塘養(yǎng)殖，并于養(yǎng)殖前對(duì)池塘底泥進(jìn)行檢測(cè)，確保底泥中不含有MG和LMG殘留，且應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)鱖養(yǎng)殖周期，以保證鱖的食用安全性。

3 結(jié)論

本研究建立了鱖體內(nèi)MG和LMG的QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法， MG和LMG在0.1～100.0 ng/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r大于0.999 8。在空白樣品中添加MG和LMG，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算LOD和LOQ，得到MG和LMG在鱖肌肉中的LOD和LOQ分別為0.10 μg/kg和0.30 μg/kg。在添加水平分別為0.30、1.5和5.0 μg/kg時(shí)，鱖肌肉中MG和LMG回收率范圍分別為(96.40±5.34)%～(104.00±1.75)%和(92.40±2.54)%～(107.00±8.42)%，精密度范圍分別為1.68%～5.54%和2.75%～7.87%，回收率和精密度均符合殘留檢測(cè)要求。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速且準(zhǔn)確性較高，適用于水產(chǎn)品中MG 和LMG殘留量測(cè)定。

本研究同時(shí)采用建立的殘留分析方法研究了陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境中鱖體內(nèi)MG和LMG殘留消除規(guī)律。結(jié)果表明，陽(yáng)性養(yǎng)殖環(huán)境中(0.2 mg/L的MG浸泡7 d后換水)，鱖體內(nèi)MG殘留以LMG為主，MG殘留量較低且變化不明顯，維持在1.0 μg/kg以下， 90 d后無(wú)檢出。鱖體內(nèi)的LMG殘留量在10.0 μg/kg以下，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，10 d時(shí)達(dá)到最高水平9.94 μg/kg，隨后呈波動(dòng)式下降，至240 d未再檢出，即其在鱖體內(nèi)消除較慢。因此，養(yǎng)殖鱖時(shí)應(yīng)檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中MG和LMG的殘留量，選擇無(wú)殘留的養(yǎng)殖環(huán)境(水體+底泥)，并適當(dāng)延長(zhǎng)養(yǎng)殖周期，以確保上市鱖體內(nèi)無(wú)MG和LMG殘留，保障其食用安全性。