杜 昆 曹昌柏

(湖北省荊州市第一人民醫(yī)院輸血科，荊州434000)

病原微生物入侵機(jī)體后，機(jī)體免疫細(xì)胞可產(chǎn)生多種促炎癥細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，并引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，其結(jié)果不利于病原體的存活[1]。然而，某些病原體能通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎癥細(xì)胞因子而抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，如IL-10，從而導(dǎo)致病原體在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期存活[2,3]。IL-10主要通過(guò)JAK/STAT(Janus Kinase/signal transducer and activator of transcription)信號(hào)通路發(fā)揮作用，首先IL-10與其受體IL-10 R1結(jié)合并激活JAK1與TyK2，激活的JAK1磷酸化IL-10 R1的兩個(gè)酪氨酸殘基Y446 與Y449，磷酸化的兩個(gè)酪氨酸殘基即成為STAT3的錨定位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子STAT3通過(guò)其SH2區(qū)域與這些部位相結(jié)合并被激活，然后STAT3形成二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合到啟動(dòng)子相關(guān)的STAT結(jié)合元件上選擇性地抑制或啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。

有文獻(xiàn)報(bào)道某些病原微生物能通過(guò)激活機(jī)體的某些信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)[2-4]。而沙眼衣原體作為一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，其整個(gè)生活周期都依賴(lài)于宿主細(xì)胞，并對(duì)宿主的多條信號(hào)通路產(chǎn)生影響[5-8]。 衣原體感染人外周血單個(gè)核細(xì)胞后能誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生[9,10]；此外，Yilma等[11]報(bào)道外源性IL-10能抑制沙眼衣原體感染細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但其機(jī)制如何以及衣原體感染誘導(dǎo)的內(nèi)源性IL-10是否有相同的作用尚不知曉。本課題旨在探討內(nèi)源性IL-10對(duì)衣原體感染人外周血單個(gè)核細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響及其機(jī)制，為防治衣原體感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，抗人IL-10抗體購(gòu)自R&D公司，人IL-10、IL-6和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，化學(xué)抑制劑Ruxolitinib購(gòu)自博歐特生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司。

1.2方法

1.2.1沙眼衣原體增殖 將 HeLa229 細(xì)胞接種到50 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞長(zhǎng)成單層 75%融合后，棄培養(yǎng)基，加沙眼衣原體L2懸液，2 h 后棄上清，更換衣原體生長(zhǎng)液(含10%胎牛血清和2 mg/L放線菌酮)，48 h后收集細(xì)胞并重懸細(xì)胞沉淀，37℃水浴與-80℃反復(fù)凍融3次，1 000 r/min離心8 min，上清即為衣原體懸液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備和沙眼衣原體的感染 抽取健康志愿者外周血10 ml注入50 ml離心管中，加入10 ml PBS并輕輕混勻；取15 ml 離心管兩支，加入Ficoll溶液5 ml，再將10 ml稀釋的血液輕輕加入兩支15 ml離心管中，2 000 r/min，20 min；用吸管將白色細(xì)胞層吸取到另一15 ml離心管中，加入PBS至10 ml，1 500 r/min，10 min，去掉上清，反復(fù)操作3次；加入5 ml含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種到96孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，加入3 MOI或如實(shí)驗(yàn)所示不同滴度的沙眼衣原體懸液作為感染組，同時(shí)設(shè)立未感染衣原體組作為對(duì)照組，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子 取細(xì)胞培養(yǎng)液上清到無(wú)菌試管中，3 000 r/min，10 min，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，取上清，-20℃保存，待所有標(biāo)本收齊后用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)上清細(xì)胞因子IL-10、IL-6和TNF-α含量。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白，取100 μg 蛋白樣品加入到等體積的2×SDS樣品緩沖液中，于沸水中加熱5 min，冷卻后立即加樣；4℃、120 V電壓電泳4 h左右；電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF(Polyvinylidene fluoride)膜中，4℃、80 V 轉(zhuǎn)移2 h；轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入特異性的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3遍，每遍10 min；加入HRP標(biāo)記的二抗IgG，室溫孵育1 h，然后TBST洗膜3遍，每遍10 min，TBS洗膜3遍，10 min，最后用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1沙眼衣原體誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-10產(chǎn)生 如圖1A所示，外周血單個(gè)核細(xì)胞在沙眼衣原體感染下，IL-10分泌增加，且隨沙眼衣原體感染滴度的增加，產(chǎn)生IL-10的量也逐漸增多。圖1B所示，3 MOI衣原體感染后8 h IL-10的產(chǎn)生量明顯增加，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生IL-10的量也逐漸增多，在48 h達(dá)到頂峰，然后下降。不同滴度的衣原體感染組和3 MOI感染8 h后各時(shí)間點(diǎn)的IL-10產(chǎn)生量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.342、9.631，均P<0.05)。

2.2內(nèi)源性IL-10對(duì)IL-6和TNF-α分泌影響 如圖2所示，在沙眼衣原體的作用下，外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6和TNF-α產(chǎn)生量均增多，但當(dāng)加入抗人IL-10抗體時(shí)，細(xì)胞IL-6和TNF-α產(chǎn)生量明顯增多，與沙眼衣原體感染但未加抗人IL-10抗體組比較，IL-6和TNF-α的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.326、11.231，均P<0.05)。

圖1 沙眼衣原體誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-10分泌Fig.1 Chlamydia trachomatis induces IL-10 secretion in peripheral blood mononuclear cellsNote: *.P<0.05.

圖2 抗IL-10抗體上調(diào)沙眼衣原體感染細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌Fig.2 Anti IL-10 antibody increases IL-6 and TNF-α secretion in Chlamydia trachomatis infected cellsNote: *.P<0.05.

圖3 抗IL-10抗體抑制沙眼衣原體感染細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化Fig.3 Anti IL-10 antibody inhibits STAT3 protein phosphorylation in Chlamydia trachomatis infect-ed cells

圖4 抑制STAT3蛋白磷酸化導(dǎo)致IL-6和TNF-α分泌增多Fig.4 Inhibition of phosphorylated STAT3 expression increases production of IL-6 and TNF-αNote: *.P<0.05.

2.3內(nèi)源性IL-10對(duì)STAT3蛋白活性影響 如圖3A所示，外周血單個(gè)核細(xì)胞在沙眼衣原體感染下，STAT3蛋白發(fā)生磷酸化，且隨沙眼衣原體感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐漸增多，呈劑量依賴(lài)性。圖3B所示，當(dāng)感染細(xì)胞中加入抗人IL-10抗體時(shí)，磷酸化的STAT3蛋白明顯減少。

2.4STAT3蛋白對(duì)IL-6和TNF-α產(chǎn)生影響 如圖4A所示，1 μmol/L化學(xué)抑制劑Ruxolitinib能明顯抑制沙眼衣原體感染細(xì)胞STAT3蛋白的磷酸化。在1 μmol/L化學(xué)抑制劑Ruxolitinib作用下，沙眼衣原體感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6和TNF-α明顯增多，與沙眼衣原體感染的未加抑制劑處理的細(xì)胞組相比，IL-6和TNF-α的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.301，P<0.05，圖4B)。

3 討論

抗炎癥細(xì)胞因子IL-10在病原體入侵時(shí)對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答起到重要的調(diào)節(jié)作用[12]。以往的研究證實(shí)衣原體能誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生IL-10[13-16]。此外，IL-10能通過(guò)抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生而抑制機(jī)體的免疫功能，從而有利于衣原體在機(jī)體內(nèi)存活[17]。這些結(jié)果表明，衣原體能通過(guò)誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)而抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，有利于衣原體在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期存活。然而，衣原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性IL-10抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚。

本研究表明，外周血單個(gè)核細(xì)胞在沙眼衣原體感染后8 h，IL-10分泌明顯增加，在48 h達(dá)到頂峰，然后下降；此外，隨著感染滴度的增加，產(chǎn)生的IL-10也逐漸增多，呈劑量依賴(lài)性。有研究表明外源性IL-10能抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[11]，但內(nèi)源性IL-10是否有相同的功能尚不知曉。本研究表明，沙眼衣原體感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生較多的IL-6和TNF-α，但當(dāng)加入抗人IL-10抗體時(shí)，細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌量明顯增多，表明沙眼衣原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性IL-10也有抑制炎癥因子產(chǎn)生的功能。由于IL-10主要通過(guò)活化STAT3蛋白發(fā)揮作用，為證實(shí)STAT3蛋白是否參與IL-10抑制衣原體感染細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，我們首先檢測(cè)IL-10是否活化STAT3蛋白。結(jié)果表明，外周血單個(gè)核細(xì)胞在沙眼衣原體感染下，STAT3蛋白發(fā)生磷酸化，且隨著感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐漸增多。但當(dāng)感染細(xì)胞中加入抗人IL-10抗體時(shí)，磷酸化的STAT3蛋白明顯減少，表明沙眼衣原體是通過(guò)誘導(dǎo)IL-10表達(dá)而活化STAT3蛋白。為進(jìn)一步證實(shí)IL-10抑制炎癥因子產(chǎn)生的功能是否與其活化STAT3蛋白有關(guān)，我們用化學(xué)抑制劑Ruxolitinib抑制沙眼衣原體感染細(xì)胞STAT3蛋白的磷酸化。結(jié)果表明，在化學(xué)抑制劑Ruxolitinib作用下，沙眼衣原體感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的IL-6和TNF-α明顯增多，提示IL-10可能通過(guò)活化STAT3蛋白抑制炎癥因子的產(chǎn)生。

有文獻(xiàn)報(bào)道，剔除IL-10基因的小鼠感染衣原體后會(huì)發(fā)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)而損害機(jī)體組織[18]，缺乏IL-10基因的細(xì)胞也不利于沙眼衣原體的存活[19]。本研究結(jié)果提示沙眼衣原體通過(guò)誘導(dǎo)IL-10活化STAT3蛋白從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生，一方面可以降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)程度，另一方面也不利于衣原體的清除，這可能是衣原體在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期存活的策略之一。