姬文蘭 王啟源 虞秀鋒 胡 萍 王亞梅

(陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)四科，西安710100)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由致病菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染所引起的人畜共患的慢性傳染疾病。MTB為胞內(nèi)寄生菌，主要寄生的宿主細胞是巨噬細胞，其進入肺部后，由宿主的第一道防線巨噬細胞所識別、結(jié)合、吞噬，使MTB激活宿主細胞內(nèi)免疫反應(yīng)，引起多種通路的活化，進而引起細胞凋亡，吞噬小體酸化，形成吞噬溶酶體，細胞吞噬作用增強，同時產(chǎn)生多種細胞因子共同發(fā)揮抗結(jié)核作用來清除感染[1]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長度約為20～25個核苷酸的非編碼RNA，可通過抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA降解從而影響多種生物學(xué)進程[2-4]。miRNAs在MTB與宿主細胞相互作用過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)感染后細胞免疫反應(yīng)和細胞命運，甚至限制細菌增殖，參與機體抗結(jié)核感染的過程[5-7]。近年來，多項研究表明多種miRNAs在MTB侵入巨噬細胞后表達量發(fā)生改變，可通過靶向關(guān)鍵基因，調(diào)控凋亡及自噬過程，進而干擾宿主細胞對MTB的清除[8-13]。因此，研究miRNAs與TB之間的關(guān)系不僅有助于闡明MTB致病和宿主應(yīng)對結(jié)核菌的免疫反應(yīng)機理，還能為TB生物標志物和治療靶標的研究提供依據(jù)。

本研究以RAW264.7細胞為研究對象，探究miR-367-3p在巨噬細胞抗卡介苗菌株(Bacillus calmette-guerin，BCG)感染機制中的關(guān)鍵作用，以期了解在BCG感染巨噬細胞過程中miR-367-3p對凋亡和自噬及介導(dǎo)的免疫效應(yīng)的影響及其機制，為探討TB發(fā)病機制、研發(fā)新的診斷與治療方法提供一定實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7(中科院上海細胞所)；Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(BD公司，美國)；Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000脂質(zhì)體(Invitro-gen公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司，美國)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Qiagen公司，德國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)；PVDF膜(Millipore公司，美國)；Bax、Bcl-2、p62、SMURF1和β-actin抗體(Abcam公司，美國)；LC3抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司，美國)；細胞凋亡檢測試劑盒Cell Death Detection ELISA kit(Roche公司，德國)；miR-367-3p抑制劑及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；BCG購自上海生物制品研究所有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將RAW264.7巨噬細胞置于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，胰酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞增殖狀態(tài)良好，進入后續(xù)實驗。

1.2.2BCG處理RAW264.7巨噬細胞 RAW264.7細胞懸液加入六孔板的各孔中，加入DMEM培養(yǎng)基，24 h后棄細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次。在每孔滴加MOI=10的菌懸液(BCG與細胞的比例為10∶1)，置于細胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2孵育。感染4 h后棄上清，目的是去除未感染進入細胞內(nèi)的細菌，更換新鮮培養(yǎng)液，此時作為細胞感染的0 h。BCG感染巨噬細胞0、6、12、24及48 h時檢測各組miR-367-3p的表達水平。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 采用LipofectamineTM2000試劑將miR-367-3p抑制劑(inhibitors)及陰性對照(Negative control，NC)轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞，嚴格按照說明書進行操作，RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA的表達水平 細胞總RNA提取按照Trizol試劑盒說明書進行操作，分光光度法測定總RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用SYBR試劑盒在ABI7500實時定量PCR儀上測定目的基因相對表達水平。采用Quantity one凝膠成像分析系統(tǒng)測定各相應(yīng)條帶的灰度值，以U6和β-actin作為內(nèi)參照，目的基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 按照全蛋白提取試劑盒說明提取細胞的總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入特異性一抗于4℃過夜孵育。TBST漂洗3×10 min后，加入辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗3×10 min后用ECL發(fā)光顯影并拍照；Western blot檢測條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描灰度值。計算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.6CFU計數(shù)檢測BCG存活率 巨噬細胞RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-367-3p inhibitors和NC 24 h，被BCG感染4 h后，用PBS洗滌以清除細胞外細菌。此后，被感染的細胞在指定的時間內(nèi)孵育，去除12孔板中的培養(yǎng)液后每孔加入500 μl 0.5% Triton X-100裂解細胞。倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞的裂解情況，待巨噬細胞全部裂解后每孔加入500 μl完全培養(yǎng)液終止裂解。振蕩混勻5 min，將稀釋后裂解物一式3份并接種至含有OADC的Middlebrook 7H10瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3周后，進行菌落計數(shù)。

1.2.7ELISA檢測細胞凋亡 將RAW264.7細胞以5×105個/ml接種于六孔板培養(yǎng)皿中，按實驗設(shè)計處理后24 h，用細胞凋亡ELISA檢測試劑盒進行檢測，參照說明書進行操作。

1.2.8生物信息學(xué)預(yù)測分析 利用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda及PicTar等預(yù)測miR-367-3p的靶基因。

1.2.9熒光素酶報告實驗 分別將含有野生型[Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitin regulatory factor-1, SMURF1)3′-UTR-WT]及突變型(SMURF1 3′-UTR-Mut)的報告基因載體和miR-367-3p inhibit-ors、NC共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，48 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒使用說明進行操作，于酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，計算螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度比值。

2 結(jié)果

2.1miR-367-3p在MTB感染的RAW264.7細胞中高表達 為探討miR-367-3p在BCG感染的免疫應(yīng)答中的作用，首先檢測BCG感染6、12、24和48 h后小鼠巨噬細胞RAW264.7中miR-367-3p的表達量，結(jié)果顯示，與0 h相比，BCG處理不同時間后，RAW264.7中miR-367-3p的表達水平均明顯升高，且24 h時miR-367-3p表達量最高(圖1A)，由此表明BCG誘導(dǎo)的miR-367-3p在BCG感染的RAW264.7細胞中具有重要調(diào)節(jié)作用。隨后為進一步探討miR-367-3p在BCG感染巨噬細胞中的作用機制，RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-367-3p inhibitors下調(diào)其表達水平，轉(zhuǎn)染效率如圖1B所示，BCG誘導(dǎo)的miR-367-3p的表達水平顯著下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2miR-367-3p抑制MTB誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡 CFU檢測胞內(nèi)BCG存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-367-3p后胞內(nèi)BCG存活率明顯降低(圖2A)，提示miR-367-3p可促進BCG在巨噬細胞中的存活。進而檢測miR-367-3p是否對BCG誘導(dǎo)的細胞凋亡有影響，ELISA結(jié)果顯示miR-367-3p下調(diào)明顯增加細胞凋亡率(圖2B)，說明miR-367-3p能夠抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細胞凋亡。同時，Western blot檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表達，結(jié)果顯示抑制miR-367-3p表達明顯上調(diào)Bax的表達并下調(diào)Bcl-2表達水平(圖2C～E)。上述結(jié)果揭示抑制miR-367-3p通過促進巨噬細胞凋亡進而加強宿主巨噬細胞對BCG的清除。

圖1 BCG感染誘導(dǎo)RAW264.7細胞中miR-367-3p的表達Fig.1 miR-367-3p expression in BCG-stimulated RAW 264.7Note: A.Relative expression level of miR-367-3p at indicated time was determined by RT-PCR analysis.*.P<0.05 vs 0 h；B.RT-PCR was carried out to evaluate the transfection efficiency of miR-367-3p inhibitors.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC；&.P<0.05 vs BCG+NC.

2.3miR-367-3p抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細胞自噬進程 為了探討miR-367-3p對巨噬細胞自噬過程的調(diào)控作用，Western blot檢測自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和p62表達水平，結(jié)果如圖3所示，下調(diào)miR-367-3p表達后，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達升高且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ數(shù)值增大，同時p62的表達水平降低(圖3)，提示miR-367-3p可抑制BCG介導(dǎo)的細胞自噬過程，從而調(diào)控胞內(nèi)BCG的存活。

圖2 miR-367-3p對BCG介導(dǎo)的巨噬細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-367-3p on BCG-mediated apoptosisNote: A.BCG survival was determined using CFU assay；B.Cell apoptosis was examined by ELISA assay；C-E.Western blot was performed to determine the protein expression of Bax and Bcl-2 in different groups.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC.

圖3 miR-367-3p對BCG感染的巨噬細胞的自噬進程的影響Fig.3 Effect of miR-367-3p on autophagy process in BCG-infected macrophagesNote: Representative Western blot and quantitative analysis showed the levels of autophagy relative protein LC3-Ⅱ and p62.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC.

圖4 miR-367-3p可直接靶向結(jié)合SMURF1的3′-UTRFig.4 miR-367-3p directly targeted 3′-UTR of the SM-URF1Note: A.Interaction sites of miR-367-3p with predicted target gene SMURF1 3′-UTR；B.The interaction between the miR-367-3p and SMURF1 detected by Dual-Luciferase Reporter Assay.*.P<0.05 vs NC.

圖5 miR-367-3p負調(diào)控SMURF1的表達水平Fig.5 miR-367-3p negative regulated SMURF1 expressionNote: A.The SMURF1 mRNA levels were determined using RT-PCR assay.B，C.The protein expression of SMURF1 was evaluated using Western blot analysis.*.P<0.05 vs NC(no BCG)；#.P<0.05 vs NC；&.P<0.05 vs BCG+NC.

2.4生物信息學(xué)預(yù)測miR-367-3p靶基因 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示SMURF1為miR-367-3p的直接靶基因(4A)。熒光素酶報告活性實驗分析結(jié)果顯示miR-367-3p inhibitors可顯著增加SMURF1-WT的熒光素酶活性，而SMURF1-Mut熒光素酶活性無明顯變化(圖4B)，說明miR-367-3p可靶向作用SMURF1的3′-UTR。

2.5miR-367-3p靶向調(diào)控SMURF1的表達 進一步采用RT-PCR和Western blot驗證miR-367-3p和SMURF1的靶向調(diào)控關(guān)系，RT-PCR結(jié)果顯示抑制miR-367-3p后SMURF1的mRNA表達量顯著升高(圖5A)。與RT-PCR結(jié)果一致，miR-367-3p下調(diào)明顯增加SMURF1的蛋白水平(圖5B、C)，該結(jié)果提示miR-367-3p能夠負調(diào)控SMURF1的表達。

3 討論

TB是一種難以根治的慢性傳染性疾病，目前研究證實多種miRNAs參與了TB的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)MTB侵入巨噬細胞后，miRNAs可通過影響巨噬細胞免疫殺傷功能在一定程度上參與機體抗MTB感染過程，因此探討miRNAs在MTB逃逸巨噬細胞殺傷過程中的作用對于揭示TB發(fā)病機制以及尋找抗結(jié)核藥物靶標就顯得尤為重要。本研究旨在探討miR-367-3p在巨噬細胞抗BCG感染機制中的關(guān)鍵作用，為TB的診斷與治療提供新途徑。研究首次發(fā)現(xiàn)miR-367-3p在BCG感染的巨噬細胞RAW264.7中上調(diào)，并呈時間依賴性，表明miR-367-3p可能參與BCG感染巨噬細胞的調(diào)控過程。

大量研究證實miRNAs通過多種免疫機制逃逸參與巨噬細胞對MTB的殺傷，如抑制巨噬細胞凋亡、抑制溶酶體水解酶降解酸化、抑制吞噬體成熟、干擾抗原呈遞、避免反應(yīng)氧和反應(yīng)氮產(chǎn)物的毒性反應(yīng)、抑制自噬等，使MTB在體內(nèi)復(fù)制[1,14]。MTB進入機體之后，巨噬細胞可以通過自身凋亡以殺死巨噬細胞內(nèi)的MTB，阻止MTB在體內(nèi)播散，并可激活鄰近未被感染的巨噬細胞，增強機體對MTB的殺傷能力；這一過程既可抑制細胞內(nèi)MTB的釋放，又可抑制菌體在宿主內(nèi)進一步的生長和繁殖[15,16]。對MTB的識別及抗凋亡機制的研究，將為TB的防治提供新的靶目標和新思路。本研究結(jié)果顯示抑制miR-367-3p可降低BCG的胞內(nèi)存活量，即下調(diào)miR-367-3p有利于BCG的清除。巨噬細胞凋亡可有效控制MTB的散播及生長，對MTB的清除具有重要作用。進一步探討miR-367-3p對BCG感染巨噬細胞凋亡的調(diào)控作用，檢測miR-367-3p對巨噬細胞凋亡率及相關(guān)靶基因表達水平的影響，研究結(jié)果揭示下調(diào)miR-367-3p通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達促進巨噬細胞凋亡進程。以上結(jié)果提示抑制miR-367-3p通過促進巨噬細胞凋亡，增強細胞免疫應(yīng)答，從而影響胞內(nèi)BCG清除，是機體對結(jié)核感染防御的主要免疫機制。

MTB作為胞內(nèi)寄生菌，以巨噬細胞為宿主。近年研究表明自噬是巨噬細胞中固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分，可以參與調(diào)控MTB在胞內(nèi)的存活及巨噬細胞對于MTB的清除作用[17]。自噬與凋亡作為程序性死亡的兩種方式，既相互獨立又緊密相關(guān)，清除機體受到外界刺激時產(chǎn)生的病變細胞及正常生命周期內(nèi)衰老細胞，進而維護機體內(nèi)環(huán)境的平衡與穩(wěn)定。在機體演變中自噬可以對凋亡產(chǎn)生一定的影響，反過來凋亡也可以通過各種信號通路介導(dǎo)進而調(diào)控自噬的程度。自噬可以做為胞內(nèi)病原體感應(yīng)機制，如果自噬受到抑制，那么將容易發(fā)生感染。自噬有利于宿主細胞清除感染的病原菌以減輕自身損傷，是機體免疫防御的重要組成部分[18]。目前已發(fā)現(xiàn)有多種途徑參與自噬的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。在感染的巨噬細胞內(nèi)，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生能促進吞噬體和溶酶體的融合，抑制胞內(nèi)MTB的存活。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在肺結(jié)核患者體內(nèi)顯著升高或降低，其通過靶向巨噬細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達從而抑制自噬，增強MTB的抗自噬能力和生存力。LC3Ⅱ是自噬小體標志蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以反映細胞發(fā)生自噬的水平。p62為自噬活化過程中的一個調(diào)節(jié)分子，與自噬程度呈負相關(guān)[19]。本實驗進一步探討miR-367-3p對BCG感染巨噬細胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-367-3p表達后自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達水平升高，而p62表達水平降低，表明miR-367-3p可抑制BCG介導(dǎo)的巨噬細胞自噬過程。上述結(jié)果提示miR-367-3p的下調(diào)可以誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生，進而促進宿主細胞對于BCG的清除作用，從而參與TB的免疫病理反應(yīng)。

繼而尋找miR-367-3p對巨噬細胞免疫殺傷功能影響的關(guān)鍵靶標，為結(jié)核病的機制的完善奠定基礎(chǔ)。SMURF1是一種與E6相關(guān)蛋白C端同源型泛素連接酶，在免疫系統(tǒng)中具有重要作用。有研究報道SMURF1缺失抑制MTB感染介導(dǎo)的自噬過程，且胞內(nèi)MTB存活率升高[20]。利用TargetScan、miRDB、PicTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-367-3p靶基因為SMUR-F1。熒光素酶報告基因活性分析顯示miR-367-3p能特異結(jié)合到SMURF1 3′-UTR，明顯抑制熒光素酶活性。進一步通過RT-PCR和Western blot方法驗證miR-367-3p對SMURF1的靶向調(diào)控作用，結(jié)果顯示miR-367-3p能夠負向調(diào)控SMURF1的mRNA和蛋白表達水平。上述結(jié)果揭示miR-367-3p能直接結(jié)合SMURF1 3′-UTR并靶向負調(diào)控其表達。

綜上所述，下調(diào)miR-367-3p可通過靶向SMUR-F1負向調(diào)控其表達，從而促進BCG介導(dǎo)的凋亡和自噬過程，揭示miR-367-3p在BCG感染的巨噬細胞凋亡和自噬途徑中發(fā)揮重要作用，同時，抑制miR-367-3p也會在BCG感染細胞后，起到促進宿主細胞對BCG的清除作用，阻止BCG的胞內(nèi)生存，為MTB的胞內(nèi)存活機制及TB的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)和新的思路。