沈立軍 孔 永 顏天銘 王玉玉 王 婧 邱玉華

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，蘇州215123)

T細(xì)胞表達的CD28是迄今公認(rèn)的經(jīng)典共刺激信號B7/CD28通路的重要組成分子[1,2]，在T細(xì)胞對抗原的特異性免疫應(yīng)答中,CD28分子作為受體與APC表達的天然配體B7-1、B7-2相互作用后,介導(dǎo)T細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激信號。該信號能增加IL-2分泌促進活化、存活以及延緩T細(xì)胞失能[3,4]。對該信號進行靶向調(diào)控，可促進機體對腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而具有潛在的應(yīng)用價值。

本研究利用本室構(gòu)建保存的鼠抗人CD28單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備CD28單抗，采用Protein A免疫親和層析法獲得純化抗體，以此為基礎(chǔ)進行分子和細(xì)胞水平的研究，分析其與重組及天然CD28的結(jié)合活性，結(jié)合動力學(xué)特性，以及對T細(xì)胞增殖的影響，以評價該抗體的體外生物學(xué)活性，并為后續(xù)體內(nèi)研究提供研究材料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑、儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone；ProteinA親和層析柱購自Merck；人CD28-小鼠IgG2a-Fc、人CD28-His購自ACROBiosystems；Zeba Spin Desalting Columns(7K MWCO)、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin、SA-HRP、小鼠抗人CD3激發(fā)抗體購自Thermo；TMB顯色液購自KPM；PE標(biāo)記的小鼠抗Biotin抗體購自Biolegend；Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液、降植烷(Pristane)購自Sigma-Aldrich；CellTiter-Glo Lumine-scent Cell Viability Assay購自Promega。Biacore(T200)、蛋白純化儀(AKTA explover 100)、Series S Sensor Chip CM5購自GE公司；尼龍毛柱購自Polysciences；高效液相色譜儀購自Waters；流式細(xì)胞儀(FACSAriaⅢ)購自BD；酶標(biāo)儀購自Molecular Devices。

1.1.2細(xì)胞株及實驗動物 能穩(wěn)定分泌鼠抗人CD28單抗的雜交瘤細(xì)胞株6E8由本實驗室制備并保存；Jurkat購自ATCC，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系本課題組保存并常規(guī)傳代培養(yǎng)；3～5周齡健康雌性裸鼠(BALB/c-nu)購自上海實驗動物中心，飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)動物管理中心SPF級動物房。

1.2方法

1.2.1雜交瘤細(xì)胞6E8的復(fù)蘇和抗體的制備與純化 取保存的雜交瘤細(xì)胞6E8，進行復(fù)蘇培養(yǎng)和擴增。收集生長旺盛的雜交瘤細(xì)胞注入已經(jīng)過Pristane致敏的裸鼠腹腔中，1×107個/只，輕輕按摩裸鼠腹部，使雜交瘤細(xì)胞充分分散在裸鼠腹腔，7～10 d后當(dāng)腹部隆起時，抽取腹水。經(jīng)3 000 r/min，離心10 min，收取上清。將上清以PBS稀釋1倍約35 ml后采用Protein A親和免疫層析法對抗體進行純化，0.25 ml/min上樣，經(jīng)柱平衡和洗脫共收集洗脫液約10 ml。洗脫液調(diào)整pH值至7.1，并經(jīng)0.22 μmol/L 過濾除菌后，測定OD280 nm進行濃度定量后分裝并于-80℃保存。

1.2.2分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)分析純度、降解和聚體 流動相為0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.2)；流速0.5 ml/min；柱溫為室溫；檢測波長280 nm，上樣量30 μg。用Waters高效液相分析儀系統(tǒng)工作站對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計算出其純度及降解、聚體比例。

1.2.3ELISA檢測抗體與重組人CD28的結(jié)合活性 采用EZ-Link?Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑按照操作說明對小鼠抗人CD28單克隆抗體進行Biotin偶聯(lián)標(biāo)記。將人CD28-小鼠IgG2a-Fc 1 μg/ml，50 μl/孔包被酶標(biāo)板2～8℃過夜后，棄去包被液，洗板，0.5%BSA-PBS封閉2 h，洗板后加入100 μg/ml起始1∶5 梯度稀釋的Biotin標(biāo)記CD28抗體50 μl/孔，置室溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢洗板，加入50 μl/孔 200 ng/ml SA-HRP置室溫反應(yīng)1 h，洗板后加入TMB進行顯色反應(yīng)，讀取OD450 nm值，并采用Softmax軟件進行四參數(shù)曲線擬合，計算EC50值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測抗體與Jurkat細(xì)胞膜表達的天然人CD28結(jié)合活性 收集對數(shù)期生長旺盛的Jurkat細(xì)胞，以PBS離心洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min，5 min。用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)后分于流式分析管中，1×106個/管，離心去除上清后分別加入100 μl/管梯度稀釋(62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0 μg/ml)的CD28 抗體，同時設(shè)置對照組。4℃條件下孵育30 min，用PBS洗2遍，再加入PE標(biāo)記的小鼠抗Biotin抗體0.5 μg/管，100 μl/管，4℃避光條件下孵育30 min。再次洗滌后，用500 μl/管PBS重懸細(xì)胞進行流式細(xì)胞儀檢測，所有數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件進行分析，采集不同劑量抗體組細(xì)胞平均熒光強度并采用Softmax軟件進行四參數(shù)曲線擬合，計算EC50值。

1.2.5表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測抗體與人CD28結(jié)合動力學(xué)特性 將人CD28-His稀釋至1 μg/ml，流穿偶聯(lián)抗His抗體的Series S Sensor Chip CM5芯片，捕獲時間為45 s，流速為10 μl/min。將CD28 抗體進行連續(xù)2倍稀釋，共計10個濃度，即濃度為：1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0 nmol/L，將稀釋完成的樣品從低濃度到高濃度依次流穿芯片進行結(jié)合、解離，結(jié)合時間為60 s，解離時間為600 s，流速 30 μl/min，檢測結(jié)束后選擇Kinetics選項中1∶1 Binding模式進行曲線擬合，以時間為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，確定其動力學(xué)常數(shù)。

1.2.6CD28抗體對外周血T細(xì)胞增殖的影響 設(shè)置以下實驗組：①用羊抗鼠IgG(20 μg/ml)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,200 μl/孔,4℃搖動過夜,棄上清,用PBS洗3遍,加入 100 μl/孔激發(fā)型CD28單抗6E8(濃度為5 μg/ml)；②用激發(fā)型CD28單抗6E8包被；③將L929-B7-1細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理后(每1×107細(xì)胞,離心棄上清,加入1 mg/ml時絲裂霉素溶液 50 μl,置于37℃、 45 min,洗滌3次),加入96孔培養(yǎng)板,5×104個/孔。 然后各實驗組分別加入經(jīng)E-花結(jié)實驗獲取的PBTC(CD3+T>95%),1×105個/孔,并調(diào)整體積至200 μl/孔。 設(shè)置相應(yīng)對照組。各實驗組均為多個復(fù)孔。部分孔2～3 d換液(原條件培養(yǎng)液),維持培養(yǎng)2周,逐日觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)活細(xì)胞總數(shù)并繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1CD28抗體的制備、純化及純度分析 采用小鼠腹水誘生法制備單克隆抗體，10只裸鼠均形成腹水，收集的腹水產(chǎn)量平均為2.1 ml/只。經(jīng)Protein A免疫親和層析法對抗體進行純化，共收集抗體洗脫液9.5 ml，經(jīng)OD280 nm測定進行定量，為2.4 mg/ml，經(jīng)計算腹水中抗體蛋白的得率為1.1 mg/ml。純化后的抗體進行分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)檢測，結(jié)果表明其純度為95.1%、降解和聚體比例分別為0.4%、4.5%。見圖1。

2.2CD28抗體結(jié)合重組及Jurkat膜表達的天然人CD28活性分析 經(jīng)ELISA檢測，結(jié)果表明CD28抗體能夠識別結(jié)合重組人CD28抗原(圖2)，其EC50值為19.8 μg/ml，同時流式細(xì)胞術(shù)檢測(圖3、4)也顯示該抗體能夠識別Jurkat細(xì)胞表達的天然人CD28分子，其EC50值為15.2 μg/ml，說明本抗體具有較好的抗原結(jié)合活性。

圖1 分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)分析CD28抗體純度Fig.1 Purity of CD28 mAb was detected by SEC-HPLC

圖2 ELISA檢測CD28抗體與重組人CD28的結(jié)合活性Fig.2 ELISA of binding activity of CD28 mAb to human recombinant antigen of CD28

圖3 FCM檢測CD28抗體與Jurkat細(xì)胞表面CD28的結(jié)合(陽性率)Fig.3 FCM of binding activity of CD28 mAb to membrane CD28 of Jurkat(positive rate)

圖4 FCM檢測CD28抗體與Jurkat細(xì)胞表面CD28的結(jié)合(平均熒光強度)Fig.4 FCM of binding activity of CD28 mAb to membr-ane CD28 of Jurkat(average fluorescent intensity)

圖5 表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測抗體與人CD28結(jié)合動力學(xué)特性Fig.5 Kinetic assay on CD28 mAb to human CD28 antigen by SPR

圖6 6E8激發(fā)的PBTC的生長曲線Fig.6 Growth curve of PBTC stimulated by 6E8Note: *.P<0.05 vs L929-B7-1.

2.3CD28抗體結(jié)合人CD28動力學(xué)特性 抗原結(jié)合親和力檢測是評價抗體結(jié)合能力的重要指標(biāo)，采用SPR技術(shù)分析了CD28與抗原的結(jié)合親和力和動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示本抗體結(jié)合CD28的親和力為2.13×10-9M，結(jié)合常數(shù)為1.55×1051/Ms，解離常數(shù)為3.30×10-41/s，顯示本抗體具有較好的親和力(圖5)。

2.4CD28抗體對外周血T細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示(圖6)，直接包被或經(jīng)羊抗鼠IgG先行包被后再加入游離6E8均能引發(fā)T細(xì)胞的活化與增殖。細(xì)胞活化的起始時間、 最大增殖強度及持續(xù)時間均較L929-B7-1刺激者強而持久(P<0.05)。

3 討論

抗細(xì)胞膜型分子的單抗，根據(jù)其與相應(yīng)抗原分子結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)不同可分為三種類型：與抗原分子結(jié)合后能增強或阻斷該分子介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，分別稱為激發(fā)型或阻斷型，抗原抗體交聯(lián)后對抗原分子功能無影響者稱為無功能型抗體。本研究在成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌激發(fā)性單抗CD28的雜交瘤細(xì)胞株6E8的基礎(chǔ)上[5]，運用SEC-HPLC及FCM對抗體的純度及結(jié)合功能進行檢測。經(jīng)小鼠腹水誘生法制備單抗，采用免疫親和層析進行純化，獲取抗人CD28單抗的純化品。為研究該抗體的生物學(xué)特性，我們選取多種不同來源的CD28抗原與之結(jié)合，分析了抗人CD28對相應(yīng)抗原分子的識別能力及介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。

雜質(zhì)控制是單抗藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性中保障藥物安全性的重要指標(biāo)，在滿足如宿主DNA、宿主細(xì)胞蛋白、proteinA殘留等單抗藥物常見的工藝殘留雜質(zhì)符合安全標(biāo)準(zhǔn)和微生物安全的前提下，還需要控制與蛋白本身相關(guān)的雜質(zhì)[6,7]。我們首先采用SEC-HPLC分析了CD28單抗的純度。結(jié)果表明其純度為95.1%、降解和聚體比例分別0.4%、4.5%，預(yù)示較低的免疫原性風(fēng)險。進而將CD28抗體與人CD28-小鼠IgG2a-Fc及Jurkat膜表達的天然人CD28結(jié)合，其EC50值分別為19.8 μg/ml及15.2 μg/ml，說明本抗體能夠識別、結(jié)合重組和天然表達的CD28，顯示出良好的結(jié)合活性。

Biacore是基于 SPR 并用于實時觀察生物分子相互作用的技術(shù)，其可得到很多傳統(tǒng)技術(shù)難以提供的生物分子相互作用信息。目前，Biacore 技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新藥開發(fā)、遺傳學(xué)分析及食品檢測等領(lǐng)域已顯示出廣闊的應(yīng)用前景[8]。本實驗使用Biacore(T200) 實時監(jiān)測了抗體與抗原的結(jié)合和解離的過程，測得CD28抗體6E8的親和力為2.13×10-9M，結(jié)合常數(shù)為1.55×1051/Ms，解離常數(shù)為3.30×10-41/s，顯示本抗體具有較好的親和力。

機體在腫瘤狀態(tài)下，腫瘤特異性T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)，CD28激發(fā)型單抗在體內(nèi)外均可有效逆轉(zhuǎn) T 細(xì)胞的耐受，再次激發(fā)其抗腫瘤效應(yīng)[9,10]。本試驗在上述研究的基礎(chǔ)上，又以羊抗鼠IgG預(yù)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后加入CD28單抗6E8，或者直接CD28單抗6E8預(yù)包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，均可引發(fā)T細(xì)胞的活化與增殖效應(yīng)。提示CD28單抗6E8為激發(fā)型單抗，其與T細(xì)胞CD28分子識別結(jié)合后，產(chǎn)生類似于天然配基B7分子的作用，刺激T細(xì)胞活化、增殖以及分化，從而介導(dǎo)免疫效應(yīng)。

靶向CD28的單抗藥物在開發(fā)和研究過程中亦有新的挑戰(zhàn)出現(xiàn)，TeGenero公司開發(fā)的治療白血病的CD28激發(fā)單抗TGN1412在藥物Ⅰ期臨床試驗中部分受試者出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，這提示靶向抗體藥物亦存在潛在的風(fēng)險，也為我們開發(fā)創(chuàng)新性單抗藥物提出了新的要求[11]。