李秀榮 孫 雪 任怡然 高瀛岱*

血清結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)又稱觸角蛋白，是一種酸性蛋白，Hp基因表達最初在肝臟中被發(fā)現(xiàn)，后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在心臟、脾臟等表達，是廣泛存在于人類和哺乳類動物的血清和體液中的α2糖蛋白[1]。Hp具有遺傳多態(tài)性，是重要的血清遺傳標(biāo)志物，位于常染色體16q22，具有兩個等位基因Hp1和Hp2，呈孟德爾共顯性遺傳，具有3種基本基因型Hp1-1、Hp2-1和Hp2-2[2]。Hp基因表型的不同源于自然選擇和遺傳漂變[3]。特異的表型與疾病類型有關(guān)，Hp1-1與易感性感染疾病相關(guān)性較大(如白血病)，在白血病相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Hp1-1純合子患白血病的概率要高于其他型，Hp1-1屬于易感基因[4]。Hp2-1與動脈粥樣硬化和自身免疫病相關(guān)性較大，Hp2-2與血管閉塞性疾病有關(guān)[5]。Hp主要作用是結(jié)合游離血紅蛋白(heamoglobin，Hb)，形成Hp-Hb復(fù)合物，Hb中釋放的游離鐵和亞鐵血紅素可參與氧化反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷，而Hp與Hb結(jié)合后通過巨噬細(xì)胞清道夫受體CD163介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進行降解和代謝[6]。Hp-Hb復(fù)合物無法通過腎小球的濾過，因而防止了血紅蛋白對腎臟的損傷[7]。CD163又稱M130，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)家族成員之一，是一種從血漿清除Hp-Hb復(fù)合物的高表達的巨噬細(xì)胞膜蛋白受體，受IL-6、IL-10和糖皮質(zhì)激素的調(diào)控[8-10]。Hp在臨床上主要作為溶血性疾病診斷的標(biāo)志物。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對人血清Hp的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等進行預(yù)測和分析，為在溶血性疾病及其他腫瘤診斷和治療等方面的研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在Uniprot在線數(shù)據(jù)庫以“Haptoglobin”為關(guān)鍵詞，搜索Hp的蛋白序列信息，并下載蛋白序列(P00738)。

1.2 方法

應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫和在線分析軟件，對Hp氨基酸序列進行多項生物信息學(xué)的分析預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 人血清Hp的理化性質(zhì)分析

利用PlatParam在線蛋白分析軟件對人血清Hp的氨基酸個數(shù)、蛋白分子量、等電點、總原子數(shù)、半衰期、蛋白不穩(wěn)定系數(shù)以及總平均親水性等理化性質(zhì)進行預(yù)測分析，分析結(jié)果顯示，人血清Hp氨基酸個數(shù)為406個；蛋白相對分子量為45205.31；總原子數(shù)為6308；等電點為6.13，表明Hp為酸性蛋白，半衰期為30 h；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)32.94，表明為穩(wěn)定蛋白；總平均親水性-0.421，為負(fù)值，表明具有一定親水性。

2.2 人血清Hp跨膜區(qū)域分析

利用在線跨膜區(qū)域分析工具TMHMM軟件，分析人血清Hp是否具有跨膜區(qū)域。分析結(jié)果顯示，人血清Hp不具有跨膜區(qū)域，為胞內(nèi)蛋白，而非跨膜蛋白，見圖1。

圖1 人血清Hp跨膜區(qū)域預(yù)測分析

2.3 人血清Hp核定位序列預(yù)測分析

使用分析工具cNLS-Mapper對人血清Hp進行核定位序列分析，其結(jié)果顯示，此蛋白有一段二元氨基酸序列 FDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAE，位于第377～406位，預(yù)測評分值(cut-off score)為2.4。根據(jù)文獻[11]報道，當(dāng)cut-off值為8～10時，表明蛋白質(zhì)專一的定位于細(xì)胞核；當(dāng)cut-off值為7或者8時，部分定位于細(xì)胞核；當(dāng)cut-off值為3～5時，定位于核內(nèi)和胞漿內(nèi)；當(dāng)cut-off值為1～2時，表明定位于胞漿內(nèi)，不具有核定位序列。因此根據(jù)分析表明此蛋白不具有核定位序列，為胞漿蛋白，見圖2。

圖2 人血清Hp NLS預(yù)測分析

2.4 人血清Hp親疏水性預(yù)測分析

通過ProtScale軟件在線分析人血清Hp的親疏水性，其結(jié)果顯示：①最強疏水性位點為第8位氨基酸，異亮氨酸(Ile，I)得分為3.011；②最強的親水性位點位于第73位氨基酸，谷氨酰胺(Gln，Q)，得分為-2.456。預(yù)測結(jié)果顯示，親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，此蛋白為親水性蛋白，蛋白理化性質(zhì)分析總平均親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.421，為親水性蛋白，與此分析結(jié)果一致，見圖3。

圖3 人血清Hp親疏水性預(yù)測分析

2.5 人血清Hp信號肽預(yù)測分析

通過SignalP 4.1 Sever在線分析軟件，分析人血清Hp是否具有信號肽，cut-off值設(shè)置為0.5，分析結(jié)果顯示：C、Y及S得分分別為0.692、0.807和0.971，分別位于第19、19和13位氨基酸上，Mean-S值為0.941，D值為0.879，D-cut-off為0.45，顯示人血清Hp具有信號肽序列，見圖4。

圖4 人血清Hp信號肽序列預(yù)測分析

圖5 人血清Hp二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 人血清Hp二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過Jpred 4在線分析軟件，分析人血清Hp二級結(jié)構(gòu)。輸入人血清Hp氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(protein Databank，PDB)內(nèi)存在已知結(jié)構(gòu)，可以繼續(xù)預(yù)測分析，其結(jié)果顯示：人血清Hp有16個β折疊結(jié)構(gòu)，2個α螺旋結(jié)構(gòu)，β折疊結(jié)構(gòu)遠遠多于α螺旋結(jié)構(gòu)，見圖5。此結(jié)果只顯示α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)，其他信息用SOPMA蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件進行分析比較。

用SOPMA在線分析軟件對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行具體預(yù)測分析，其結(jié)果顯示：人血清Hp氨基酸序列由14.29%的α螺旋、6.4%的β轉(zhuǎn)角、24.38%的延伸鏈和54.93%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成，無規(guī)則卷曲為人血清Hp的主要折疊形式，α螺旋多于β轉(zhuǎn)角，見圖6。

圖6 人血清Hp二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

2.7 人血清Hp三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

Swiss-model軟件是基于同源建模的方法，實現(xiàn)對一段未知序列的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。高級結(jié)構(gòu)與蛋白功能相關(guān)性較大，研究蛋白的功能必須要掌握蛋白的高級結(jié)構(gòu)特征。通過Swiss-model在線分析軟件，對人血清Hp進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析，其結(jié)果顯示得到3個預(yù)測結(jié)構(gòu)圖，見圖7。

圖7 人血清Hp三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

圖7中A圖預(yù)測結(jié)構(gòu)與模板序列相似度為81.13%，相似性波形圖值在0.73左右，覆蓋度0.78；B圖預(yù)測結(jié)構(gòu)與模板序列相似度為32.96%，相似性波形圖值在0.64左右，覆蓋度0.88；C圖預(yù)測結(jié)構(gòu)與模板序列相似度為29.13%，相似性波形圖值在0.45左右，覆蓋度0.63。根據(jù)相似度、波形圖及覆蓋度判斷模型A的預(yù)測結(jié)構(gòu)可靠性更高。

為進一步驗證模型A的可靠性，使用在線分析軟件The Structure Analysis and Verification Server進行拉曼圖譜分析，其結(jié)果顯示：經(jīng)預(yù)測所得的蛋白模型A除一個甘氨酸(符號標(biāo)識：▲)外其余所有氨基酸殘基都位于可接受區(qū)域內(nèi)(顏色越深，接受度越高)，第316位絲氨酸(Ser)和第227位賴氨酸(Lys)位于普通接受區(qū)，其余氨基酸都位于較高的接受區(qū)。結(jié)果表明所有氨基酸間能形成合理的二面角，使蛋白結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，由Swiss-model軟件基于同源建模的方法得到的人血清Hp三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測模型穩(wěn)定可靠，見圖8。

2.8 人血清Hp相互作用蛋白預(yù)測分析

通過String在線分析軟件，對與人血清Hp相互作用的蛋白進行預(yù)測分析，其結(jié)果顯示，有11個相互作用蛋白，并對這11個相互作用蛋白進行評分(見表1)，預(yù)測了11種蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。

圖8 人血清Hp預(yù)測三級結(jié)構(gòu)模型A的拉曼圖分析

圖9 與人血清Hp互相作用的蛋白預(yù)測分析

表1 與人結(jié)合蛋白互相作用的蛋白

Hp蛋白與Hb結(jié)合后，形成Hp-Hb復(fù)合物，通過CD163介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進行代謝，防止游離的血紅蛋白對腎臟的損傷作用，與CPR互相作用，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。APOA1為載脂蛋白A的一種，是卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活化劑，該酶可將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，促進膽固醇的運輸和調(diào)節(jié)HDL代謝，防止動脈硬化性心血管疾病的發(fā)生。人血清Hp蛋白還具有抗菌、抗氧化的作用。

2.9 人血清Hp功能注釋分析

通過Gene Ontology在線分析軟件對Hp進行功能(gene ontology，GO)注釋，從生物學(xué)過程上來看，Hp主要參與蛋白質(zhì)的水解作用，與Hb互相結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物；參與受體介導(dǎo)的胞吞作用，Hp-Hb復(fù)合物通過巨噬細(xì)胞清道夫受體CD163介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進行降解、代謝；參與急性炎癥反應(yīng)；具有細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)作用；具有抗菌作用等。從細(xì)胞組分而言，Hp為胞漿蛋白，可與Hb形成Hp-Hb復(fù)合物。從分子功能而言，Hp具有蛋白結(jié)合作用；抗氧化活性；血紅蛋白結(jié)合作用等。GO注釋結(jié)果與蛋白互作結(jié)構(gòu)一致，見表2。

表2 人血清Hp的 GO注釋分析結(jié)果

3 討論

人血清Hp是一種親水性酸性蛋白，屬于急性時相蛋白家族成員，與Hb結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物，Hb產(chǎn)生游離鐵和亞鐵血紅素可參與氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機體產(chǎn)生損傷，Hp-Hb復(fù)合物的產(chǎn)生防止Hb對機體的損傷作用。在血管內(nèi)溶血性疾病，如溶血性貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)；血清學(xué)指標(biāo)顯著下降，被認(rèn)定為一項臨床診斷指標(biāo)。Hp參與炎性反應(yīng)，具有抗菌、抗氧化作用，促進血管生成作用，與冠心病、糖尿病、高血壓、血液疾病、自身免疫病及惡性腫瘤都有相關(guān)性，還具有抗氧化活性、抗菌作用、抑制一氧化碳、血管生成、調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用。Hp是一種急性期蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)時，血清濃度升高；在發(fā)生溶血時血清濃度降低。當(dāng)發(fā)生血管內(nèi)溶血時，如溶血性貧血、PNH、HS，血清中Hp的水平顯著下降，Hp檢測已作為臨床溶血疾病診斷的常規(guī)指標(biāo)。在感染、組織損傷過程中，Hp合成水平明顯增強，反映了急性反應(yīng)的狀態(tài)[12]。Hp除參與炎性反應(yīng)、溶血等，在腫瘤免疫抑制中也起重要的作用[13]。在肺癌、肝癌、卵巢癌等癌癥患者的血清中具有較高的表達，此血清標(biāo)志物聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物對疾病早期特異性診斷有較大參考價值和意義[14]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Hp參與很多的生命活動，因此對Hp的生物信息學(xué)研究具有重要價值。

本研究通過生物信息學(xué)的手段對Hp基本生物信息進行預(yù)測分析，其結(jié)果表明，Hp不具有跨膜序列，是胞內(nèi)蛋白，具有親水性，無核定位序列，具有信號肽序列，主要在胞漿內(nèi)行使功能。二級結(jié)構(gòu)分析顯示主要有β-折疊、α-螺旋、延伸鏈及無規(guī)則卷曲等組成。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型經(jīng)驗證也具有較高的穩(wěn)定性，可信度較高。蛋白互作和GO注釋結(jié)構(gòu)顯示Hp參與血管生成、炎性反應(yīng)、抗菌作用及蛋白結(jié)合等過程，結(jié)合游離血紅蛋白，并由CD163介導(dǎo)的內(nèi)吞作用代謝。本研究通過生物信息學(xué)的方法得到的Hp的預(yù)測結(jié)構(gòu)具有可靠性，對后期研究血清Hp參與的生理功能和機制研究具有指導(dǎo)意義，同時結(jié)合血紅蛋白及結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物對疾病的早期診斷和靶向藥物的研究具有基礎(chǔ)作用。

4 結(jié)語

隨著生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)的發(fā)展，生物信息學(xué)作為一項重要的研究手段已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到結(jié)果分析及預(yù)測中，并在臨床研究中發(fā)揮重要的作用。