張 恒，李金星，陳思穎，丁海霞，余 水， 彭麗娟,4*

(1.黔西南州煙草公司 安龍縣分公司，貴州 安龍 552400；2. 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

煙草黑脛病與煙草青枯病是我國烤煙生產(chǎn)中最具破壞性的土傳病害，每年造成巨額經(jīng)濟損失，貴州省是我國烤煙生產(chǎn)的主要產(chǎn)區(qū)之一，煙草黑脛病與青枯病發(fā)生也尤為嚴(yán)重[1-2]，每年由病害造成的經(jīng)濟損失將近億元[3]，嚴(yán)重影響煙農(nóng)的經(jīng)濟收入。目前生產(chǎn)上對這2種病害的防治方法主要有：種植抗(耐)病烤煙品種；清潔田園及輪作為主的農(nóng)業(yè)防治措施；化學(xué)藥劑防治等綜合防治措施。但生產(chǎn)實際中尚無合適的抗(耐)優(yōu)良品種；由于耕地有限，有些煙地不得不連作[4]。因此，生產(chǎn)上大多采用化學(xué)藥劑防治控制病害。目前藥劑防治由于可供選擇藥劑品種少，主用藥劑的使用年限長，病原菌的抗藥性逐年增加[5-6]，農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等負(fù)面效應(yīng)也逐步增加[7]。因此，生物防治近年來已發(fā)展成為煙草病害防治研究的熱點領(lǐng)域[8-9]。

使用芽孢桿菌進行植物病害的防治是生物防治研究的熱點領(lǐng)域之一[10]，芽孢桿菌具備了產(chǎn)業(yè)化的前提條件，適應(yīng)性廣；作用機制多樣，不易產(chǎn)生抗藥性；發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低；能形成芽孢、易儲運；環(huán)境友好，對人畜安全。芽孢桿菌因其獨有的生理特性和理化性質(zhì)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保和軍事領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用研究價值。[11]利用芽孢桿菌開發(fā)生防制劑成為重要方向[12]。對于煙草土傳病害(煙草黑脛病和煙草青枯病)生防芽孢桿菌的篩選國內(nèi)外也有一些學(xué)者進行了嘗試[9, 13-17]。據(jù)筆者調(diào)查，貴州煙草黑脛病與煙草青枯病常常混合發(fā)生。篩選同時可防治這2種病害的芽孢桿菌，目前未見報道。本研究從貴州省黔西南州安龍縣烤煙種植地塊，采集烤煙根際土壤，從中分離、篩選同時拮抗煙草黑脛病菌與青枯病菌的芽孢桿菌菌株，建立芽孢桿菌資源庫，為之后貴州煙草病害生防制劑的研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1土樣采集

于2017～2018年從貴州省黔西南州安龍縣煙草黑脛病和青枯病發(fā)病地塊采集健康煙株根際土樣，采用5點取樣法，將同一地塊土樣混合算1份土樣。具體采集時間、地點見表1。使用紙袋收集土樣，土壤采集工具提前消毒，避免土壤微生物混雜。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于芽孢桿菌分離保存，篩選拮抗煙草青枯病菌的芽孢桿菌平板對峙實驗[17-18]；PDA培養(yǎng)基用于篩選拮抗煙草黑脛病菌的芽孢桿菌平板對峙實驗[17-18]。

1.1.3供試菌株

煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)和煙草青枯病菌(Ralatoniasolanacearum)由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供。

1.2 根際芽孢桿菌分離與保存

采用稀釋平板法，將土壤稀釋懸浮液于85 ℃水浴30 min以殺死絕大部分非芽孢細(xì)菌。取100 μL稀釋液涂LB平板，每濃度涂平板3個，37 ℃培養(yǎng)1 d后，挑取不同單菌落，純培養(yǎng)并保存于-80 ℃冰箱[18]。

1.3 煙草黑脛病菌與青枯病菌拮抗芽孢桿菌篩選

通過平板對峙法篩選拮抗煙草黑脛病菌與青枯病菌效果明顯的芽孢桿菌，通過初篩與復(fù)篩觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，十字交叉法測量其抑菌直徑[19-20]。

抑菌率(%)=[(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/處理組菌落直徑]×100

1.4 生防菌株鑒定

通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA基因?qū)Y選的菌株進行鑒定[21]。

1.4.1菌落形態(tài)觀察

接種菌株至含有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37 ℃過夜搖培，離心收集菌體，無菌水清洗3次菌體，用無菌水重懸并稀釋至濃度1×108CFU/mL，在LB液體和固體培養(yǎng)基上滴加10 μL菌液，37℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落形態(tài)[21]。

1.4.2生理生化特征

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[22]，對菌株生理生化特性進行測定。

1.4.3分子生物學(xué)鑒定

50 mg/mL溶菌酶37 ℃水浴1 h處理菌體，采用Biomiga細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，16S rDNA 通用引物27F/1492R[23]進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物驗證正確后送上海生工進行測序。測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，并利用CLUSTAL X軟件進行多序列比對和系統(tǒng)進化分析軟件MEGA6.0中的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙根際芽孢桿菌資源庫的建立

在安龍縣主要烤煙種植生態(tài)區(qū)的主栽品種上采集健康煙株根際土壤共15份，分離根際芽孢桿菌(見圖1)，建立烤煙根際芽孢桿菌資源庫(見表1)，共保存芽孢桿菌662株。

(a)稀釋涂板得到芽孢桿菌單菌落；(b)純化菌株；(c)保存菌株圖1 烤煙根際土壤中分離芽孢桿菌并保存Fig.1 Isolation and preservation of Bacillus strains from tobacco rhizosphere soil

表1 土壤樣品采集Tab.1 Information of soil samples

2.2 煙草黑脛病菌與青枯病菌拮抗芽孢桿菌篩選

以煙草黑脛病菌(P.nicotianae)和青枯病菌(R.solanacearum)為供試植物病原菌，采用平板對峙法篩選同時可拮抗2種病原菌的芽孢桿菌，經(jīng)初篩與復(fù)篩，得到拮抗效果較好的芽孢桿菌2株，分別編號為AL203和AL210(圖2～圖5)。

CK：煙草青枯病菌(R. solanacearum)；AL203、AL210表示篩選到的具有拮抗效果的芽孢桿菌菌株圖3 芽孢桿菌對煙草青枯病菌拮抗效果初篩Fig.3 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward R. solanacearum in the first screening

(a)煙草黑脛病菌(P. nicotianae)；(b)(c)表示篩選到的具有拮抗效果的芽孢桿菌菌株圖4 芽孢桿菌對煙草黑脛病菌拮抗效果復(fù)篩Fig.4 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward P. nicotianae in the second screening

(a)煙草青枯病菌(R. solanacearum)；(b)(c)為篩選的具拮抗作用的芽孢桿菌菌株圖5 芽孢桿菌對煙草青枯病菌拮抗效果復(fù)篩Fig.5 Biocontrol efficacy of bacterial isolates toward R. solanacearum in the second screening

2.3 生防菌株鑒定

AL203、AL210均可在LB固體與液體培養(yǎng)基上形成比較復(fù)雜的菌落結(jié)構(gòu)(圖6)。菌株的生理生化特性見表2，2菌株均為G+，均可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，均產(chǎn)生過氧化氫酶和硝酸還原酶，甲基紅染色陽性，可液化明膠等特征。通過16S rDNA基因序列分析，構(gòu)建菌株AL203、AL210的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株AL203、AL210與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)聚到一個分支(圖7)。AL203、AL210的16S rDNA基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號分別為MK103124和MK103125。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA基因鑒定AL203、AL210為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖6 菌株AL203、AL210在LB液體、固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology on liquid and solid LB media

生理生化特征AL203AL210革蘭氏染色Gram stain++VP試驗Voges Proskauer tests++甲基紅Methyl red tests++檸檬酸鹽Citrate++過氧化氫Catalase++淀粉水解Starch hydrolysis++明膠液化Gelatin liquefactiong++硝酸還原酶Nitrate reductase++亞硝酸還原酶Nitrite reductase--葡萄糖Glucose++α-L-鼠李糖alpha-L-Rhamnose ++甘露醇mannitol ++

+：陽性反應(yīng)；-：陰性反應(yīng)

圖7 菌株AL203和AL210 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic analysis of Bacillus strains based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié)論與討論

本研究從貴州省黔西南州安龍縣煙草黑脛病和青枯病發(fā)病嚴(yán)重地塊采集健康煙株根際土壤15份，從中分離得到芽孢桿菌662株，建立烤煙根際芽孢桿菌資源庫。從中篩選分離到2株芽孢桿菌AL203、AL210，具同時拮抗煙草黑脛病菌(P.nicotianae)與青枯病菌(R.solanacearum)的能力。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA基因鑒定，AL203、AL210為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

解淀粉芽孢桿菌作為一種安全、高效、多功能和極具開發(fā)潛力的芽孢桿菌已經(jīng)成功商品化應(yīng)用投放市場，如由解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) FZB42作為主要成分的殺菌劑BioYield，可防治多種植物真菌和細(xì)菌病害[21]，因此AL203、AL210也具備開發(fā)成商品化制劑的潛力。解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)抑制植物病原菌，研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌抗真菌活性來源于環(huán)脂肽類抗生素，而抗細(xì)菌活性則可能由于聚酮類物質(zhì)和核糖體合成途徑產(chǎn)生的細(xì)菌素[21]。這些物質(zhì)可抑制細(xì)菌生長和真菌菌絲生長及孢子的萌發(fā)[22]。但不同芽孢桿菌基因組差異較大，因此，AL203、AL210產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)還需進一步研究。AL203、AL210均能夠在液體和固體培養(yǎng)基表面形成較為復(fù)雜的菌落形態(tài)，前人研究表明生防芽孢桿菌形成的復(fù)雜的菌落結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮定殖能力的先決條件，而定殖也是生防菌發(fā)揮生防功能的前提的條件[21]，因此AL203、AL210具備潛在的優(yōu)秀的定殖能力和生防潛力。下一步將通過研究AL203、AL210對煙草黑脛病與青枯病的田間防治效果來進一步驗證。

本研究是貴州生態(tài)區(qū)域和種植模式下收集合適的防治煙草土傳病害效果良好的生防芽孢桿菌進行初步研究，為以后相關(guān)生防制劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。