姚莉梅，石 磊， 李海波，尚 昆，朱青青，周光榮，江 龍*

( 1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州梵凈山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，貴州 江口 554400)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal， AM)真菌是屬于球囊菌門(Glomeromycota)中的一類營養(yǎng)共生真菌，可與大多數(shù)植物形成共生體[1]。按照http:// www.amf-phylogeny.com網(wǎng)站上整理公布的數(shù)據(jù)，目前在世界范圍內(nèi)發(fā)表的AM真菌共有4目11科36屬334種，中國記錄近兩百種[2]。梵凈山國家自然保護(hù)區(qū)位于貴州省銅仁市，是武陵山脈主峰，1992年被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為具有全球意義的A級保護(hù)區(qū)，2018年被列入“世界自然遺產(chǎn)名錄”。全區(qū)生態(tài)系統(tǒng)保存完好，基本沒有人為擾動，是當(dāng)今地球同緯度生物多樣性保存最為完好的地區(qū)，擁有高等植物303科1266屬3728種，是研究AM真菌物種多樣性的極佳樣地[3]。目前僅陶光耀[4]與袁騰[5]進(jìn)行了初步調(diào)查，鑒定報道的AM真菌種類12屬42種，接近國內(nèi)AM真菌物種數(shù)量的1/4，說明該保護(hù)區(qū)AM真菌種類十分豐富。因此開展梵凈山自然保護(hù)區(qū)土壤中AM真菌的調(diào)查與研究，在豐富我國叢枝菌根真菌資源和開發(fā)應(yīng)用方面有重要意義。通過對梵凈山植物根際土壤AM真菌的物種鑒定，我們發(fā)現(xiàn)了三個國內(nèi)新記錄種，現(xiàn)予報道。

1 材料與方法

1.1 采集土樣

采樣地位于貴州省銅仁市梵凈山自然保護(hù)區(qū)，采集土樣時，除去土壤表面約2 cm的腐殖土與雜質(zhì)，采集距離地表約5～30 cm土層土壤，約1 kg裝入采樣袋中，自然風(fēng)干后放4℃冰箱中進(jìn)行保存以備用[6]。

1.2 分離鑒定

土壤AM真菌孢子采用濕篩傾注-蔗糖離心法[7]進(jìn)行分離。在體視顯微鏡下對分離到的孢子進(jìn)行其大小、形狀、顏色及連孢菌絲進(jìn)行初步觀察及分類，再將孢子洗凈后吸取到載玻片上，置于生物顯微鏡(Olympus BX53)和攝影系統(tǒng)(Olympus DP70)下，對孢子大小、形狀、顏色、連孢菌絲、孢子壁及發(fā)芽壁的層數(shù)和厚度、孢子壓破后的內(nèi)含物及在Melzer’s試劑中的染色情況、孢子表面有無紋飾或附著物等特征進(jìn)行詳細(xì)觀察、記錄，并照相[8]。再依據(jù)http:// www.amf-phylogeny.com網(wǎng)站、國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM)(http://invam.caf.wvu.edu)、和http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota等網(wǎng)站提供的種屬描述及其相應(yīng)的圖片，結(jié)合貴州大學(xué)AM真菌保藏資源，進(jìn)行屬種鑒定，中文學(xué)名參見王幼珊等(2017)[9]球囊菌門叢枝菌根真菌最新分類系統(tǒng)菌種名錄。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)孢子形態(tài)學(xué)鑒定，從貴州省銅仁市梵凈山自然保護(hù)區(qū)植物根際土壤中共分離、鑒定出AM真菌中國新記錄種3種，雙型囊霉屬(Ambispora)、多樣孢囊霉屬(Diversispora)、隔球囊霉屬(Septoglomus)各1種。下面是詳細(xì)描述和圖示。

2.1 網(wǎng)紋雙型囊霉Ambispora reticulata Oehl & Sieverd(2012).(圖1)

孢子果未見。孢子在土壤中單生，幼嫩孢子白色，成熟孢子黃棕色，球形至近球形，大小89～140 μm。孢子壁有2層，L1為透明至淡黃色，厚1 μm左右，隨著孢子成熟逐漸消失，成熟孢子幾乎不可見；L2為無色透明至淺黃色，厚2～5 μm，在Melzer’s試劑中發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)紫紅色。孢子壁兩層：GW1兩層緊貼，均為無色透明膜狀壁，GW1-L1半柔性，厚1.1～3.0 μm，表面具有特殊的網(wǎng)狀紋飾，有由脊包圍的不規(guī)則形狀的凹坑，形狀為三邊形到八邊形，寬3.2～9.6 μm，深0.5～2.1 μm；GW1-L2光滑，厚1 μm左右，在Melzer’s試劑中不發(fā)生反應(yīng)；GW2雙層：GW2-L1為透明剛性壁，厚1.3～3.5 μm，GW2-L2透明，厚度很薄，很難觀察到，發(fā)芽壁在Melzer’s試劑中無反應(yīng)。孢子梗：由孢子壁和發(fā)芽壁的外層延伸形成，在孢子基部寬6～16 μm×4～17 μm，GW1-L1的網(wǎng)狀紋飾延伸到孢子梗呈波浪狀紋飾。在Melzer’s試劑中不反應(yīng)[10]。

Fritz Oehl(2010)[10]在瑞士阿爾卑斯山和亞高山草原上首次發(fā)現(xiàn)網(wǎng)紋雙型囊霉Ambisporareticulata，觀察到第一層發(fā)芽壁上有特殊的網(wǎng)狀紋飾結(jié)構(gòu)，是區(qū)分雙型囊霉屬其它物種的識別特征。我們從梵凈山植物根際土壤中分離得到的孢子經(jīng)過觀察，在第一層發(fā)芽壁上可明顯觀察到該種的識別特征-網(wǎng)紋紋飾結(jié)構(gòu)(圖1-1,4,7～12)，且紋飾的形狀(圖1-4)、寬度與深度(圖1-9,11～12)也與該種識別特征一致，此外孢子顏色、大小及其與Melzer’s試劑的反應(yīng)結(jié)果(圖1)與Fritz Oehl的描述一致，因此確定為網(wǎng)紋雙型囊霉Ambisporareticulata。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可見孢子梗 4.特殊網(wǎng)紋紋飾 5. Melzer’s試劑中的完整孢子，孢子壁L2層有紫紅色反應(yīng) 6-7.破裂孢子在水中的孢子壁及發(fā)芽壁結(jié)構(gòu) 8-12. Melzer’s試劑中的破裂孢子，L2層有紫紅色反應(yīng)，GW1、GW2和孢子梗均沒有反應(yīng)，呈現(xiàn)微黃色

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spore in water phase, spore stalk can be seen 4.special reticulatad pattern 5.complete spore in Melzer's reagent, and purple red reaction in L2 layer of spore wall 6-7.spore wall and sprouting wall structure of broken spores in water 8-12.broken spores in Melzer's reagent showed purple red reaction in L2 layer, while GW1, GW2 and spore stalk showed slight yellow reaction

圖1 網(wǎng)紋雙型囊霉
Fig.1 Morphological characters ofAmbisporareticulata

標(biāo)本號：Inl20181025FJ-5、Fas20181025FJ-41、Fas20181025FJ-48、Rhs20181025FJ-108、Rhg2018 1025FJ-112、Rhs20181025FJ-113、Rhr20181025FJ-118、Inb20181025FJ-128、Int20190725FJ-8、Imst-20190725FJ-13、Cajt20190725FJ-25、Fas20190725FJ-31、Inl20190725FJ-41、Que20190725FJ-53、Phy-20190725FJ-81，孢子于2018年10月從貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)闊葉箬竹Indocalamuslatifolius、箭竹Fargesiaspathacea、貴州杜鵑Rhododendronguizhouense、大鐘杜鵑Rhododendronririei、巴山箬竹Indocalamusbashanensis，以及2019年7月從黃金鳳Impatienssiculifer、巴東櫟Quercusengleriana、山茶Camelliajaponica、箭竹Fargesiaspathacea、毛竹Phyllostachysedulis、箬竹Indocalamustessellatus、闊葉箬竹Indocalamuslatifolius根際土壤中分離得到。

2.2 光亮多樣孢囊霉Diversispora clara Oehl, B. Estrada, G.A. Silva & Palenz. (2012).(圖2)

孢子果未見。孢子在土壤中單生，透明至奶白色，球形(63～112 μm)或近球形(67～127×63～122 μm)。孢子壁三層：L1透明，厚度<1 μm，在成熟過程中逐漸消逝，因此在成熟孢子中經(jīng)常不存在；L2層狀壁，明亮至較少的乳白色，厚度3～5.3 μm；L3透明，厚1 μm左右，通常與L2緊密粘附，不易觀察。L1和L2在Melzer’s試劑中被染色為黃色，孢子細(xì)胞的內(nèi)容物為油狀液滴，在Melzer’s試劑中被染成比細(xì)胞壁更深的黃色。孢子具有亮白色連孢菌絲，常單生，形狀為圓柱形，空隙少見打開，常在基部或離基部較近處由L2和L3的隔膜封閉[11]。

Beatriz Estrada(2011)[11]等人從西班牙10種金盞花植物根際土壤中首次發(fā)現(xiàn)光亮多樣孢囊霉Diversisporaclara，該種孢子顏色較該屬其他孢子透明，孢子壁較薄，連孢菌絲圓柱形，且在孢子基部或離孢子基部較近的地方有隔膜封閉。我們分離到的孢子顏色透明(圖2-2～4)、孢子壁較薄(圖2-4～8)，連孢菌絲圓柱形且在離孢子基部較近處有隔(圖2-3)，孢子形態(tài)特征與Beatriz Estrada等人描述一致，由此確定為光亮多樣孢囊霉Diversisporaclara。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可見連孢菌絲 4.破裂孢子，可見孢子壁結(jié)構(gòu) 5-8. Melzer’s試劑中的孢子壁結(jié)構(gòu)，孢子壁L2被染成暗黃色結(jié)構(gòu)，L3不反應(yīng)

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spores and hyphae can be seen in the water phase 4.broken spore, spore wall structure can be seen 5-8.spore wall structure in Melzer's reagent, spore wall L2 was stained dark yellow structure, and L3 did not react

圖2 光亮多樣孢囊霉
Fig.2 Morphological characters ofDiversisporaclara

標(biāo)本號：Inl20181025FJ-5、Fas20190725FJ-38、Int20190725FJ-45，孢子于2018年10月從闊葉箬竹Indocalamuslatifolius以及2019年7月從貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)箬竹Indocalamustessellatus和箭竹Fargesiaspathacea根際土壤中分離得到。

2.3 高山隔球囊霉Septoglomus altmontanum Palenz., Oehl, Azcón-Aguilar & G.A. Silva (2013).(圖3)

孢子果未見。土壤中單生，深紅棕色至紅黑色，形狀橢圓形至近球形，大小130～190×121～167 μm。孢子壁兩層：L1為半透明至暗黃色壁，光滑，厚2.2～3.7 μm；L2為深紅棕色至紅黑色的層狀壁，厚4.0～7.6 μm，兩層孢子壁在Melzer’s試劑中不發(fā)生反應(yīng)。連孢菌絲顏色稍淺于孢子顏色，為暗黃色至紅色，形狀為圓柱形，偶爾為漏斗形，常發(fā)生彎曲；常在孢子基座處達(dá)到最寬19～31 μm，連孔常被L2延伸形成隔。連孢菌絲與Melzer’s試劑中也不發(fā)生反應(yīng)[12 ]。

Javier Palenzuela(2013)[12]等人在對麥冬根際土壤叢枝菌根真菌進(jìn)行調(diào)查時，首次報道了高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum。該種孢子較大，顏色較深，尤其是連孢菌絲較寬，最寬處可達(dá)35 μm，是高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum與該屬其他種區(qū)分的主要識別特征[11]。我們分離的孢子連孢菌絲結(jié)構(gòu)最寬處可達(dá)31 μm(圖3-7～8)，在孢子顏色、形狀上都與Javier Palenzuela等人的描述一致(圖3)，因此確定為高山隔球囊霉Septoglomusaltomontanum。

標(biāo)本號：Irt20181025FJ-38、Fas20181025FJ-60、Woj20190725FJ-72、Phh20190725FJ-28、Hys-20190725FJ-30、孢子于2018年10月從貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)鳶尾Iristectorum、箭竹Fargesiaspathacea，以及2019年7月從狗脊蕨Woodwardiajaponica、臘蓮繡球Hydrangeastrigosa、毛竹Phyllostachysedulis根際土壤中分離獲得。

梵凈山國家級自然保護(hù)區(qū)原生生態(tài)系統(tǒng)保存完好，因其獨(dú)特的氣候及地理位置，具有梵凈火絨草、梵凈山冠唇花、梵凈山鎧蘭等許多特有的生物物種[13]，梵凈山AM真菌資源也十分豐富，目前我們已經(jīng)在該保護(hù)區(qū)共分離鑒定出13屬58種AM真菌，占全球AM真菌種質(zhì)資源17%，占國內(nèi)29%。此次三個新記錄種的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步說明梵凈山自然保護(hù)區(qū)AM真菌的物種多樣性豐富。

1.反射光 2.透射光 3.水相中完整孢子，可見孢子壁L1和連孢菌絲 4.破裂孢子，可見孢子壁L2和連孢菌絲隔膜 5-8.Melzer’s試劑中的孢子壁結(jié)構(gòu)和連孢菌絲隔膜結(jié)構(gòu)，孢子壁L2和連孢菌絲均不反應(yīng)

1.reflected light 2.transmitted light 3.complete spores in the aqueous phase, with spore wall L1 and hyphae hyphae visible 4.broken spores, spore wall L2 and hyphae septum can be seen 5-8.spore wall structure and hyphae membrane structure, spore wall L2 and hyphae did not respond in Melzer's reagent

圖3 高山隔球囊霉
Fig.3 Morphological characters ofSeptoglomusaltomontanum